华南虎染色体带型分析*

任小冬 龚志海 饶伟强 雷胜桥 刘力军 李秋明

（1.广东粤北华南虎省级自然保护区管理处， 广东 韶关 512023；2.杭州艾迪康医学检验中心有限公司， 浙江 杭州 310030）

华南虎Panthera tigris amoyensis是中国特有的虎亚种，曾在中国中南部大部分地区都有分布，野外已近三十年未有其确切的踪迹报道。全国现存圈养种群均为20 世纪五六十年代捕获的6 头（2 雄4 雌）华南虎的后代。虎的起源主流观点认为是200 万年前起源于中国中南部，发现于中国河南渑池的古中华虎Panthera tigris palaeosinensis化石，最接近这一原始虎的亚种是华南虎，因为其前倾的眼窝及细小的头颅等头骨结构与古中华虎极其相似[1]。因此，华南虎被多数学者认为是所有虎亚种祖先的直系后代，在虎的亚种分化和遗传机制方面具有较高的学术价值。由于现存圈养华南虎种群是一个高度近亲的种群，造成遗传疾病多发，其种群生育率和幼崽成活率均较低，近期就有一例华南虎染色体变异的G 带核型报道[2]。华南虎的染色体早在1991 年就有研究[3]，G 带核型1993 年也曾有报道[4]，并对华南虎和东北虎Panthera tigris altaica的染色体核型进行了对比分析，认为两个虎亚种G 带带型没有差异。已有的研究表明猫科动物的核型大多数为2n=38，认为猫科动物G 带带型与家猫的完全一致或高度相似[5-6]，核型非常保守。多位国外学者先后绘制了家猫不同分辨率的G 带模式图及其染色体分带命名[7]，虽然华南虎染色体G 显带也有研究和报道[2-4]，但华南虎G 带模式图未有人进行详细研究。

染色体是生物细胞中的一个重要组成部分，它是遗传信息（基因）的主要载体[8]。所谓显带染色体是指染色体标本经过一定程序处理，并运用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现出明暗或深浅相间的横行带纹，称之为染色体带，这种染色体带显现的技术，称为显带技术[9]。染色体显带反映了调节DNA 复制﹑修复﹑转录和遗传重组的基因组功能结构。基因检测结果显示华南虎和东北虎具有显著的遗传差异，也确定了与繁殖﹑疾病﹑捕食和代谢相关的功能基因和调节途径，并表征了与野外生存相关的功能性基因[10]。华南虎的核型分带研究对于构建华南虎的高密度遗传连锁图谱和QTL 图谱具有重要作用。

本研究组近期报道了华南虎G 显带模式[11]，现结合R 显带技术对华南虎染色体进行详细带型对照，对比华南虎染色体显带模式与家猫的异同，能为华南虎的细胞遗传学研究提供更为详实的基础资料，鉴于细胞遗传学在医学上以及在保护濒危物种方面的重要性，能为未来的华南虎繁育研究和物种保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液 华南虎血液（采集自后肢或尾部静脉）采自广东某华南虎繁育研究基地。血样采集使用肝素钠抗凝真空采血管，采血后应轻轻颠倒混匀数次，使抗凝剂与血液充分接触﹑溶解，防止凝固。血样采集后在48 h 内进行接种，静脉血样本在运输过程中避免剧烈晃动，冷藏（2～8 ℃）或常温（18～25 ℃）运输均可，实验室收到标本当日无法及时接种以及接种后不能马上培养的标本需冷藏（2～8 ℃）保存。累计采集到8 头华南虎的血样，其中雄性6 头，雌性2 头。

1.1.2 主要仪器和试剂 OLYMPUS CX41 显微镜﹑以色列ASI 染色体核型分析系统﹑美国热电HEPA CLASS 100 二氧化碳培养箱﹑广州白云山拜迪生物医药淋巴细胞培养液﹑舒泰﹑多咪静﹑咹啶醒﹑肝素钠抗凝真空采血管等。

1.2 培养方法

分别取0.4 mL 肝素钠抗凝静脉血接种于2 瓶淋巴细胞培养液中，混匀后置于37 ℃二氧化碳培养箱培养72 h。培养完成后加入40 ug/mL 的秋水仙素20 uL，作用80 min 后收获淋巴细胞，收获步骤为：培养细胞转移至15 mL 离心管，离心去上清，加入0.075 mol/L KCL 低渗，37 ℃水浴，离心去上清，细胞预固定，细胞固定，再次细胞固定。吸取固定好的细胞悬液 5～6 滴均匀滴于冰玻片上，过火，80℃烤片1 h（R 显带时不用烤片），分别进行胰酶G 显带和R 显带处理，Giemsa 染色。在低倍镜下寻找良好染色体分裂相，用高倍油镜观察选取染色体形态清晰﹑分散良好﹑背景干净的中期分裂相，并进行显微摄影。

1.3 带型分析方法

G 显带和R 显带样本各选取10 个分散良好﹑染色深浅适宜﹑显带清晰的中期分裂相进行计数和测量，分别计算相对长度﹑臂比值和着丝粒指数的均值及标准差。并用染色体核型分析系统进行拍片﹑存档。根据以着丝粒位置进行分类的方法[12]确定染色体形态。主要根据相对长度﹑臂比值及着丝粒指数等进行染色体形态划分，本文采用臂比值均值作为确定形态依据，臂比值大于1 而小于1.67 的为中部着丝粒染色体（m）﹑臂比值大于1.67 而小于3.0 的为亚中部着丝粒染色体（sm）﹑臂比值大于3.0 而小于7.0 的为亚端着丝粒染色体（st）﹑臂比值大于7.0 的为端着丝粒染色体（t），性染色体X 是中着丝粒染色体（m），性染色体Y 是亚中着丝粒染色体（sm）。依据《ISCN2013》[13]（人类细胞遗传学国际命名体制）对华南虎的染色体带型进行分组分类和分析对比，并按照分析结果绘出华南虎各条染色体带型模式图。

2 结果与分析

2.1 华南虎染色体形态特征及带数

依照染色体相对长度大小递减排列，常染色体依次为1～18，性染色体分别为X 和Y（表1）。其中，常染色体中带数最多的为24 条带，带数最少的为6 条带；性染色体中X 染色体为12 条带，Y染色体是相对长度最短也是带数最少的染色体，仅3 条带。所有染色体中7 号和8 号的长度和形态都极为近似，区别仅为7 号染色体比8 号染色体短臂靠近着丝粒位置多一条浅染带。

表1 华南虎染色体核型形态特征及带数Table 1 Karyotype morphological characteristics and banding number of South China tiger

从G 带结果来看，华南虎各条染色体均具有独特的带型特征，华南虎雌性和雄型的常染色体带型没有区别，性染色体能明显区分华南虎的性别（图2～3）。

图1 雄性华南虎染色体G 显带Fig.1 Chromosome G banding of male South China tiger

图2 雌性华南虎染色体G 显带Fig.2 Chromosome G banding of female South China tiger

2.2 华南虎G 带模式、G 带和R 带比较

经对华南虎的G 带[11]和R 带进行带型研究初步形成了华南虎的G 带核型，19 对染色体都能显示出较为细致的带纹。从带型上来看，同源染色体带纹基本一致，带纹在每一对染色体上的数目和分布具有明显的特征。不同长度的染色体具有不同的带纹，一般染色体长度越长带纹越多。各条染色体分带模式根据G 带带纹分布制作而成，R带作为辅助手段校正着丝粒和带纹的分布，将华南虎染色体G 带模式﹑G 带和R 带分别进行对照（图3）。

图3 华南虎G 带模式、G 带和R 带对照Fig.3 South China tiger G banding karyotype pattern、G banding and R banding contrast

2.3 华南虎G 带命名方法

与华南虎相近的猫科动物中已有人对家猫的染色体带型进行了命名[14]，其命名规则参考了人类细胞遗传学国际命名体制中的染色体分带的区﹑带命名方法，将该方法应用于华南虎染色体带型研究，方便进行染色体各条带的定位和比较。人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）汇聚了染色体专家的智慧，其中的惯例和方法值得借鉴和应用。华南虎1 号染色体带型命名（图4）按照ISCN 方法沿染色体的臂从着丝粒开始向远端连续标记区和带。p 和q 分别用于表示染色体的短臂和长臂，着丝粒区定义为10，向着短臂部分称为p10，面向长臂的部分称为q10。每条臂上与着丝粒相连的部分定义为1，稍远的区定义为2，依次类推[13]。作为界标的带一般认为属于该界标远端的区，并且该带常被标定位该区的1 号带。

图4 华南虎1 号染色体的区、带命名示例Fig.4 Example of nomenclature of chromosome 1 of region and band of South China tiger

在定义一个特定的带时，需要下列4 个条件：（1）染色体号，（2）臂的符号，（3）区号，（4）该带在所属区的带号。这些条件需要连续列出，中间不要有空格和间断。例如1p12 表示1 号染色体短臂1 区2 带（图4）。

使用以上方法可以清晰地分辨染色体的每条带纹的编号，如1q32 表示1 号染色体长臂上3 区第2 条带（图4），在应用中可方便定位染色体每一条带的大致位置，从而判断华南虎染色体带纹是否存在异常，也可以利用该方法将华南虎与东北虎等其他虎亚种的染色体带纹进行比较，看看两者在染色体核型带纹形态上是否具备显著差异。对比前人的东北虎染色体G 带研究[4,15]，显示其核型与本文华南虎核型分组结果有个别差异，这种差异可能是测量误差和计算差异造成。

3 结论与讨论

3.1 华南虎是我国国家一级重点保护野生动物，也是我国特有虎亚种，其已被认为野外灭绝，濒危程度远超国宝大熊猫。因猫科动物的核型模式非常保守，家猫的染色体核型在国际上普遍被作为猫科动物的核型模式。家猫的G 带模式和分带编号已有报道[7]，将染色体分成6 组和性染色体组。其中A 型（大亚中着丝粒染色体）6 条﹑B 型（大亚端着丝粒染色体）8 条﹑C 型（大中着丝粒染色体）4 条﹑D 型(小亚中着丝粒染色体)8 条﹑E 型（小中着丝粒染色体）8 条﹑F 型（端着丝粒染色体）4 条和性染色体X﹑Y。为方便与家猫的带型进行比较，图3 按其顺序进行了排列，经比较，华南虎与家猫的染色体G 显带高度相似，但也存在少部分明显区别。如华南虎D3 短臂上存在一条较粗的深染带，而家猫D3 短臂上只有较浅的深染带；华南虎F1 着丝粒远端明显为浅带更宽，家猫F1 着丝粒远端明显为深带更宽。

染色体标本片的制备受较多因素影响，实验材料﹑秋水仙素浓度﹑处理时间﹑低渗溶液种类﹑滴片时温差等均可对染色体的实际长度﹑相对长度及臂比值产生影响[13]。本文经采集多头华南虎血液培养进行G 显带和R 显带实验，带型经多次比对具有一定的代表性，基本可以排除因实验原因造成与家猫带型的差异。目前华南虎染色体带型的研究还处于初级阶段，希望能给以后高分辨的带型研究提供参考，便于以后学者进行华南虎染色体研究时横向比较某些或某条染色体易位和变异等情况。

3.2 华南虎的G 带同家猫的分带高度近似，表明猫科动物在遗传上的同源性。显带方法的分子基础涉及核苷酸碱基组成﹑相关蛋白和基因组功能结构，染色体带的分布决定着某些基因的位置，在染色体核型带型识别时，这些连续的染色体带分布特征具有重要意义。在本研究中，我们对华南虎的G 带命名方法进行了示意（图4），对比家猫而言，华南虎的分带命名的精确性仍有待提高。同家猫染色体带型[7]比较图3 中B2﹑B3﹑B4 和E1 及Y 染色体的分类彼此不同，解决这些差异需要使用顺序条带技术对两者R 带和G 带进行直接比较。本研究成功制备华南虎染色体G 带和R 带标本，初步形成华南虎染色体G 带模式，希望为华南虎等濒危物种的种群遗传研究提供参考。