苹婆炭疽病病原菌生物学特性及室内毒力测定*

王 成 赵丹阳 扈丽丽 赵 奕 高成龙 张心结陈诗琦 黄华毅

（1.广东省龙眼洞林场，广东 广州 510520；2.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州510520；3.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642）

苹婆Sterculia monosperma隶属于锦葵科Malvaceae 苹婆属Sterculia，是常绿的木本淀粉植物，又称凤眼果﹑枇杷果﹑富贵子﹑九层皮﹑潘安子等[12]。在我国主要分布于广东﹑广西﹑台湾﹑福建﹑云南﹑贵州等地，国外印度﹑越南﹑印度尼西亚﹑日本也均有种植[3-4]。苹婆种子营养价值高，具有重要保健作用和药用价值；树液富含树胶，可作为工业原料；树皮富含纤维，可作为造纸原料或用于制作麻袋﹑绳索及人造棉等。苹婆枝叶茂盛﹑树冠整齐﹑花果奇特，具有较高的观赏价值，根系发达﹑适应性强，适宜作为行道树和景观树[1-2,5-9]。

目前，已报道的苹婆主要病害有煤烟病和炭疽病[10]，苹婆在温暖多雨季节多发炭疽病，造成叶枯﹑脱落现象，发病时其老叶的病变呈圆形或不规则形状的褐色或灰白色病斑；在嫩叶上，病斑为黄褐色，从叶尖边缘迅速蔓延到叶片上，形成大的坏死病变，干燥并最终脱落，严重影响其光合作用[4]。苹婆炭疽病的病原菌于2019 年首次从广西分离获得，最终鉴定为暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense。2020 年在广西的假苹婆Sterculia lanceolata上也发现了该病原菌导致的炭疽病[11]。目前，有关苹婆炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌的生物学特性研究尚未见报道。本研究为了明确苹婆炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌的生物学特性和有效防治的化学药剂，测定了该病原菌的生物学特性，并筛选出高效的防治药剂，为苹婆炭疽病的有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

1.1.1 菌株 苹婆炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌C.siamense菌株PT-2 由广东省林业科学研究院分离﹑纯化并保存。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基和查彼（Czapek）培养基的配制参考方中达[12]的方法。查氏培养基（碳源）：碳源3.00 g﹑磷酸氢二钾1.00 g﹑氯化钾0.50 g﹑硫酸镁（Mg-SO4·7H2O）0.50 g﹑硫酸铁（FeSO4）0.01 g﹑硝酸钠2.00 g﹑琼脂17.00 g﹑蒸馏水1.00 L。查氏培养基（氮源）：氮源2.00 g﹑磷酸氢二钾1.00 g﹑氯化钾0.50 g﹑硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g﹑硫酸铁（FeSO4）0.01 g﹑蔗糖30.00 g﹑琼脂17.00 g﹑蒸馏水1.00 L。

1.2 供试药剂

98%溴菌腈﹑97%嘧霉胺﹑95%啶酰菌胺﹑98%嘧菌酯﹑96.8%苯醚甲环唑和98%福美双原药粉末均由中国农科院植保所廊坊农药厂生产。

1.3 菌株生物学特性测定

1.3.1 菌株对碳、氮源的利用 以Czapek 培养基为基础培养基，分别用等量的9 种碳源﹑氮源置换其中的蔗糖和硝酸钠[13]，倒平板（直径9 cm，下同），然后用6 mm 无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘取菌饼，并分别接种至不同碳﹑氮源的培养基中央，以不加碳﹑氮源为对照，28 ℃恒温黑暗培养7 d，7 d 后观察病原菌的生长 ，并采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3 次，下同。

1.3.2 pH 值对菌株生长的影响 将PDA 培养基的pH 值用1 mol·L-1盐酸和氢氧化钠溶液调整为4.0﹑5.0﹑6.0﹑7.0﹑8.0﹑9.0﹑10.0﹑11.0﹑12.0﹑13.0 共10 个处理。然后用6 mm 无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘取菌饼，分别接种至不同pH 值的PDA 培养基中央，28 ℃培养7 d 后，观察病原菌的生长情况并测量菌落直径。

1.3.3 光照对菌株生长的影响 用6 mm 无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘取菌饼，接种至PDA 培养基中央，分别置于24 h 光照﹑12 h 光暗交替﹑24 h 黑暗条件下28 ℃恒温培养，7 d 后观察病原菌的生长情况并测量菌落直径[14]。

1.3.4 菌株致死温度的测定 用无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘打取直径6 mm 的菌饼，挑入装有1.5 mL 无菌水的2 mL 离心管中，分别置于35﹑40﹑45﹑50﹑55 和60 ℃的金属浴中加热10 min，后将菌饼接种至PDA 培养基平板中央，28 ℃培养，观察病原菌是否生长。

1.3.5 温度对菌株的影响 用6 mm 无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘取菌饼，接种至PDA 培养基平板中央，分别置于5﹑10﹑15﹑20﹑25﹑28﹑30﹑35﹑40﹑45 和50 ℃黑暗条件下恒温培养，7 d 后观察病原菌的生长并测量菌落直径。

1.4 菌株室内药剂筛选

暹罗炭疽菌的室内药剂筛选采用菌丝生长速率法。使用30%二甲基亚砜（DMSO）溶液复溶供试的6 种药剂原药粉末，分别设置成5 个质量浓度（T1～T5)，并分别与PDA 培养基混合后制成带药平板，每个带药平板中含有10 mL 混合了药剂的PDA 培养基，以PDA 培养基中加入等量30%DMSO 溶液为对照。药剂名称及浓度见表1。用6 mm 无菌打孔器从菌株PT-2 菌落边缘取菌饼，分别接种至各个带药平板和对照组平板中央，28 ℃培养7 d 后测量菌落直径，计算相对抑制率[15-16]。

表1 供试药剂及浓度Table 1 Fungicides evaluated and concentration

1.5 数据分析

运用SPSS 26.0 软件计算毒力回归方程﹑半最大效应浓度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）和相关系数（R2）；并使用Duncan法对数据进行显著性差异分析；图表在Excel 2016中绘制完成。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌株生长的影响

如图1 所示，不同的碳源病原菌生长情况差异显著。在缺碳源的查氏培养基中，菌丝生长较差，菌丝较薄，呈现透明状，菌落直径为50.3 mm。而添加了碳源的培养基上病原菌菌丝生长茂盛，呈白色。其中，碳源为乳糖和纤维素粉的培养基中，病原菌生长速度最快，菌落直径分别为56.5 mm和57.8 mm；碳源为可溶性淀粉的培养基中的病原菌生长速度最慢，为42.2 mm。

图1 病原菌暹罗炭疽菌在不同碳源培养基中菌丝生长情况Fig.1 The mycelial growth of C. siamense in different carbon sources

2.2 氮源对菌株生长的影响

氮源对病原菌生长的影响差异显著（图2）。氮源为硝酸钠和缺氮源的情况下，病原菌长势一般，菌落呈透明状，菌丝薄；而其他添加氮源的培养基中，菌丝生长茂盛，菌落呈白色，菌丝较厚。以胰蛋白胨为氮源的培养基中，病原菌生长速度最快，菌落直径为58.5 mm，菌丝生长速度最慢的氮源培养基为硫酸铵和氯化铵，氮源为硫酸铵的培养基的菌落直径分别为21.5 mm，氮源为氯化铵培养基菌落直径为22.0 mm。

图2 病原菌暹罗炭疽菌在不同氮源培养基中菌丝生长情况Fig.2 The mycelial growth of C. siamense in different nitrogen sources

2.3 pH 值对菌株生长的影响

如图3 所示，病原菌在pH 值为4.0～13.0 均能生长，pH 值为7 时菌落生长最快，菌落直径为77 mm，pH 值为5.0-8.0 时，比较适合病原菌的生长。病原菌在pH 值低于5.0 时和大于8.0 之后菌落生长速度明显变慢。

图3 病原菌暹罗炭疽菌在不同pH 值中菌丝生长情况Fig.3 The mycelial growth of the C.siamense in different pH

2.4 光照对菌株生长的影响

从图4 中可以看出，病原菌生长受光照影响明显。菌落在全光照条件下生长最快，菌落直径为77.0 mm；全黑暗条件下，菌落生长最慢，菌落直径为75.6 mm。

2.5 菌株的致死温度

经测定，55 ℃为病原菌的致死温度，经过35﹑40﹑45 和50 ℃处理后的菌饼均能在PDA 平板中生长，而55 ℃和60 ℃处理后的菌饼不再生长。

2.6 温度对菌株生长的影响

从图5 中可以看出，温度对病原菌生长的影响差异性显著。在28 和30 ℃下菌落生长速度较快，菌落直径分别为76.3 mm 和77.5 mm；而当温度低于20 ℃和大于30 ℃时，菌落生长受到抑制，菌落直径明显下降；40 ℃及以上温度，菌落不再生长。

图5 病原菌暹罗炭疽菌在不同温度下菌丝生长情况Fig.5 Effects of culture temperature on mycelial growth of C.siamense

2.7 不同药剂对菌株室内毒力效果

不同供试药剂对菌株PT-2 生长的抑制效果见表2，96.8%苯醚甲环唑的抑菌效果最佳，EC50值为5.24 μg/mL；其次是98%溴菌腈和98%福美双，EC50值 分 别 为23.41 μg/mL 和38.72 μg/mL。97%嘧霉胺﹑95%啶酰菌胺和98%嘧菌酯的EC50值范围在100～200 之间，表明该病原菌对于这3种药剂也较敏感。

表2 6 种药剂对菌株PT-2 的室内毒力测定结果Table 2 The results of toxicity of 6 fungicides on C. siamense

3 结论与讨论

苹婆炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌的生物学特性的测定，明确了该病原菌生长最适氮源为胰蛋白胨，最适碳源为纤维素粉和乳糖，最适pH 值7.0，不同光照条件下对其生长影响差异不显著，其致死温度为55 ℃，最佳生长温度范围为28～30 ℃。筛选出了96.8%苯醚甲环唑可作为该病原菌的潜在高效杀菌剂。

暹罗炭疽菌寄主繁多，目前已发现果树类番石榴Psidium guajava﹑枣Ziziphus jujuba﹑芒果Mangifera indica等[17-19]；观赏植物类金森女贞Ligustrum japonicum﹑紫背竹芋Stromanthe sanguinea[20]﹑中药材类紫山药Dioscorea alata[21]等寄主，还能引起草莓根腐病[22]﹑多肉植物黑腐病[23]及其他植物的炭疽病等多种病害，造成叶片枯斑﹑植株萎蔫﹑腐烂等症状，给农林业生产上带来了巨大的经济损失。

由于寄主不同，病原菌的生物学特性呈现出一定的差异[19,23-24]。在碳源的利用率上，橡胶炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌对半乳糖﹑乳糖的利用率最强；对纤维素﹑可溶性淀粉最弱；青星美人黑腐病的病原菌暹罗炭疽菌最佳碳源为麦芽糖；芒果炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌最佳碳源为淀粉，在乳糖中营养生长最慢。而在氮源的利用率上，橡胶树炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌对硝酸钠﹑硝酸钾﹑磷酸二氢铵和蛋白胨的利用率都较好，青星美人黑腐病的病原菌暹罗炭疽菌最佳氮源为酵母浸膏，芒果炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌对牛肉膏的吸收利用最好。但各寄主上暹罗炭疽菌病原菌对硫酸铵利用率都较差，硫酸铵对病原菌的生长起抑制作用。寄主为橡胶树和芒果的暹罗炭疽菌病原菌的最佳生长温度相近，分别为24 和25 ℃；而苹婆和青星美人上的暹罗炭疽菌病原菌的最佳生长温度一致，均为30 ℃。橡胶树上的暹罗炭疽菌病原菌最适pH 值范围较广，为5.0～9.0；而在芒果和青星美人上的暹罗炭疽菌病原菌生长最快的pH 值为5.0，与苹婆上分离出的病原菌pH 值7.0 略有差异。光照对苹婆﹑芒果上的暹罗炭疽菌病原菌的营养生长没有影响；而光暗交替适合青星美人上的病原菌菌丝生长，连续黑暗适合其产孢。

化学药剂速效﹑稳定，仍是当前防治植物炭疽病的主要手段之一[25-26]。根据6 种杀菌剂对苹婆炭疽病的病原菌暹罗炭疽菌的抑菌结果显示，6 种杀菌剂对病原菌都具有较好抑菌效果，其中96.8%苯醚甲环唑表现出了最好的抑菌作用，能有效抑制病原菌的生长。这与王志华等[27]在金森女贞上的暹罗炭疽菌病原菌得出的结论一致。除此之外，经药效试验和室内药剂筛选，咪鲜胺﹑吡唑嘧菌酯﹑甲基硫菌灵[28]﹑多菌灵[27]﹑和氟环咪鲜胺[29]分别对广东咖啡﹑金森女贞和油茶上的暹罗炭疽菌病原菌的毒力效果较好。

通过暹罗炭疽菌的生物学特性进行研究，明确了苹婆炭疽病病原菌的生活习性，测定了6 种杀菌剂对病原菌的室内毒力效果，并筛选出对病原菌抑制效果最强的药剂，为苹婆炭疽病的防控提供了理论支撑。