超声辅助低共熔溶剂提取五味子中木脂素类化合物的工艺

马晓星，韩翠艳，朱文全，梁桂林，袁橙*

(1.齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

0 引言

低共熔溶剂(deep eutectic solvents, DESs) 是一种含有至少一个氢键受体(HBA，包括氯化胆碱、甜菜碱、氯化铵、甲基三苯基溴化磷等)和一个氢键供体(HBD，包括可再生羧酸、多元醇、糖等)的共晶混合物[1]。与传统溶剂相比，DESs 显示出了一些环境和经济上的优势，包括可调黏度、高生物降解性、低毒性、对极性和非极性化合物的高萃取能力，并且DESs 是多元体系，可以任意组合，制备方法简单，容易存储，更容易选择适宜的组分，在很多领域有着广泛的应用前景[2-6]。

五味子(五梅子)因其具有五味(咸、甜、酸、辣、苦)而得名。在中国的文化中，五味子作为药材已经使用了数千年。五味子被《中国药典》正式列为镇静补剂。其中的五味子木脂素已被证明具有多种生物活性，如：肝保护作用[7]、强抗氧化特性[8]、抗癌活性[9]等。

然而，传统的醇提或水提仍用于五味子生物活性成分的提取[10-12]，存在使用大量昂贵、易燃、难以去除和有毒的有机溶剂和萃取率低的缺陷。因此，本研究重点考察了氯化胆碱基DESs 的合成及其在木脂素类化合物提取中的潜力，并首次在超声辅助下从五味子中提取生物活性化合物，为从天然植物中生理活性化合物的提取提供绿色溶剂和新技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子果实采自齐齐哈尔医学院药园；五味子醇甲对照品110764-201915、五味子酯甲对照品111529-201706、五味子甲素对照品110857-201815、五味子乙素对照品110765-201813(中国食品药品检定研究院)、氯化胆碱、乙二醇、乳酸、1，4-丁二醇、苹果酸、尿素、丙二酸、色谱甲醇。

高效液相色谱仪、超声机、微波炉、离心机、电子天平、水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 DESs 的制备

将氯化胆碱和乙二醇(乳酸、1,4-丁二醇、苹果酸、尿素、丙二酸)按一定摩尔比混合于圆底烧瓶中。水浴锅加热到80 ℃，磁力搅拌(100 r/min)，一直加热搅拌到澄清透明状态，待冷却后装瓶常温保存(如表1 所示)。

表1 不同体系DESs

1.2.2 木脂素得率测定方法的建立

采用高效液相色谱检测五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等四种活性化合物的得率。色谱柱 Agilent Eclipse XDB C18Column (250×4.6 mm，5 µm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；流速1.0 mL/min，进样量：20 µL；检测波长254 nm。分别精密称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素对照品10 mg 置于10 mL 容量瓶中，分别加甲醇定容制成浓度约为1 mg·mL-1的溶液，再稀释成不同浓度的对照品溶液，微孔滤膜(0.45 μm)过滤于离心管中封口保存，分别记录不同溶液的浓度，待检测，绘制标椎曲线。

五味子醇甲等四种活性化合物线性回归方程相关系数分别为：

1.2.3 五味子木脂素的提取

分别称取五味子粉末1.00 g 放入50 mL 锥形瓶中，再分别加入10 mL(含水量20%) 的氯化胆碱型低共熔溶剂(料液比1∶10)，搅拌混合均匀后用封口膜封口，放入超声机中超声时间40 min、超声温度50 ℃、超声功率600 W。超声提取后，取出放入离心管中离心10 min(10 000 r/min)取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)过滤于离心管中封口保存，作为供试品溶液。

1.2.4 DESs 的筛选

使用表1 中的DESs 提取五味子木脂素，按上述色谱条件检测，记录每个DES 下五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的峰面积，根据各成分的标准曲线计算得率比较，筛选最佳的DES。

1.2.5 物理辅助方法的筛选

分别采用超声法、微波法、负压空化法、回流法辅助最佳的DESs 提取木脂素，记录每种物理辅助方法下五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的峰面积，根据各成分的标准曲线计算得率比较，筛选最佳的物理辅助方法。

1.2.6 单因素实验

本研究分别从含水量、料液比、超声温度、超声时间和超声功率5 个因素考察最佳DES 的提取条件。含水量分别设定为10%、20%、30%、40%、50%；料液比分别设定为1∶8、1∶10、1∶12、1∶15；超声温度分别设定为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；超声时间分别设定为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min；超声功率分别设定为420 W、480 W、540 W、600 W。以总木脂素的提取量为评价指标，选出较好的提取条件，平行测定3 次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 DESs 的确定

不同体系的DESs 具有不同理化性质，比如溶解性、极性、密度、黏性等，会不同程度的影响提取五味子木脂素类化合物。本实验比较了氯化胆碱与不同类型的氢键供体制备的不同DES 体系对提取木脂素得率的差异，结果如图1 所示。由图1 可知，提取五味子木脂素类化合物的最佳低共熔溶剂体系是氯化胆碱-乳酸(1∶1)，总木脂素得率达到13.06 mg/g。可能是因为氯化胆碱-乳酸(1∶1)DES 与木脂素的作用力较强，有助于目标成分的溶出。

图1 不同种类DESs 对五味子木脂素提取率的影响

2.2 物理辅助方法的确定

不同物理辅助方法对五味子木脂素类化合物得率如图2 所示，总木脂素得率大小为超声法> 微波法> 回流法> 加压法，筛选出提取五味子木脂素类化合物的最佳物理辅助提取方法是超声法，总得率为13.06 mg/g。

图2 不同物理辅助方法对总木脂素得率的影响

2.3 单因素实验结果

2.3.1 含水量对木脂素得率的影响

在DESs 中，加水是降低黏度和调节化合物溶解度的有效方法。然而，由于水具有较强的极性，高的含水量会破坏HBD、HBA 和目标化合物之间平衡的相互作用。由图3(a)可知，随着低共熔溶剂的含水量增加，木脂素的总提取得率呈现先增加后降低的趋势，当含水量达到20% 时，提取得率最高。

图3 单因素实验结果

2.3.2 料液比对木脂素得率的影响

料液比会对萃取化合物有一定的影响。萃取剂不足会导致提取效果不佳，而过量时则会造成提取剂的浪费，甚至对提取效果不利。从图3(b) 中可以看出，当料液比为1∶8～1∶10 时，木脂素的总提取率先缓慢增加，当料液比1∶10～1∶15 时，提取得率逐渐下降。随着料液比的增加，加大了五味子与低共熔溶剂之间的接触面积，使得五味子粉末充分侵润，增强了木脂素类成分向低共熔溶剂的扩散，这就提高了木脂素类成分的得率。若当料液比过大，料液的接触面积达到了饱和，受到的超声作用减少。

2.3.3 萃取温度对木脂素得率的影响

由图3(c)可知，随着提取温度的升高，木脂素的总提取得率呈现先升高后降低的趋势。当超声温度为50 ℃时，提取得率达到最高。温度升高可加速传质扩散，降低溶剂黏度，表面张力会降低，扩散性会增加，有利于萃取分离。并且适当的升高温度可以提供更多的热量和软化植物组织，使目标化合物更容易扩散到萃取介质中，提高萃取率。然而，过高的温度也会增加能量消耗，破坏一些热敏性化合物的稳定性，从而降低提取效率。

2.3.4 萃取时间对木脂素得率的影响

一般来说，提取在短时间内完成，提取时间过长会增加成本，甚至不利于提取。由图3(d) 可知，随着超声时间的增加，木脂素的总提取得率呈现先增加后降低的趋势。当超声时间达到40 min 时，提取的效果最好得率最高。超声波的时间越长，产生的能量越高，在提取溶剂中形成的空化效应越大，提取得率越高。但是当超声时间过长，使得提取溶剂的挥发以及木脂素的降解，导致提取得率的降低。

2.3.5 超声功率对木脂素得率的影响

萃取过程的超声功率是研究的一个重要参数，因为其不仅可以最大限度地提高提取物中生物活性化合物的浓度，而且可以最大限度地降低提取过程的能量成本。如图3(e)所示，在将超声功率从420 W增加到540 W 的过程中，对总木脂素的产率没有显著影响，但当超声功率达到600 W 时，总木脂素的产率较之前显著提高。随着超声功率的增加，空化效应更强，分子的运动速度和加速度增加，分子的扩散速度更快，超声对细胞壁的断裂效应更强，木脂素的溢出率增加。

3 结语

本研究以DESs 氯化胆碱类DESs 为提取溶剂对五味子中木脂素进行超声辅助提取，确定了萃取效果最佳的DES 为氯化胆碱-乳酸(1∶1)。单因素考察实验结果表明最佳工艺条件：料液比为1∶10；含水量20%；超声温度50 ℃；超声时间40 min；超声功率600 W。在此条件下测得的木脂素类化合物总得率是13.06 mg/g。超声辅助提取五味子木脂素类化合物具有操作简单、成本低廉、绿色环保等优点，本研究为五味子木脂素类化合物的开发利用提供一定的技术支撑和理论依据。