网络药理学探讨雾水葛防治II型糖尿病的物质基础及作用机制

李汉成，曾 茗，莫紫娇，马德运

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061）

糖尿病是一种由多因素相互作用所致的代谢性疾病，由于胰岛素分泌缺乏和生物作用障碍，导致糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等代谢紊乱.据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）统计，2021年全球糖尿病患者已经达到5.37亿，预计在2030年可达到6.43亿[1].随着我国居民生活水平的提高及生活方式的改变，糖尿病已经成为继心血管疾病及肿瘤之后的第三大疾病，给居民带来沉重的经济负担并严重影响其生活质量.2021年我国糖尿病患者达到1.4亿，位居世界首位，60岁以下患者超过40%，其发病特点呈现年轻化趋势，其中约90%为II型糖尿病[2].

中医认为II型糖尿病属于“消渴”范畴，并发现“三多”（多饮、多尿、多食）是II型糖尿病患者常表现的症状.“消渴”首次记载于《素问·奇病论》中，认为经常吃又甜又肥腻的食物是II型糖尿病患者患病原因之一，患者摄入过多甘美肥腻的食物后导致了脾运失常，脾热上溢，最终导致了消渴症.雾水葛，最早见于清代《生草药性备要》，后见于《岭南采药录》，其来源于荨麻科植物雾水葛的带根全草，在广东、广西等许多气候温暖的省份均有分布.雾水葛作为一味传统中药，味甘、淡，性寒，其清热解毒、清肿排脓、利水通淋等功效与中医治疗II型糖尿病的理念不谋而合.雾水葛在广东民间被广泛应用于降血糖，尤其是广东粤西地区，老百姓从野外采摘雾水葛全株，洗净泥土及杂质，晾干，用水煎服以控制血糖，这一用药习惯在当地老百姓中已经较为普遍，疗效得到广泛认可.此外，岑欢等人发现其对服用了小剂量及中剂量雾水葛水煎剂的糖尿病小鼠有明显的降血糖作用[3].

目前，应用雾水葛治疗II型糖尿病的理论研究尚且处于初期阶段，缺少对其降血糖靶点及作用机制的研究.本文通过网络药理学对传统中药雾水葛治疗II型糖尿病的物质基础及作用机制进行探讨，为雾水葛治疗II型糖尿病的临床应用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 雾水葛活性成分的筛选及基因靶点的预测

通过文献调研查找雾水葛活性成分，通过化源网（https://www.chemsrc.com）获取主要成分CAS 号，通过pubchem（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）数据库获取主要成分的2D 结构.借助SwissADME 数据库上对雾水葛的主要成分进行筛选，以胃肠道吸收度高Gl absorption High、并同时满足药物相似性中Druglikeness 中（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）含有两个yes 为指标筛选出活性成分.通过Swiss Target Prediction（swisstargetprediction.ch）预测雾水葛活性成分作用靶点.

1.2 获取疾病相关基因

在GeneCards（https://www.genecards.org）数据库中设置物种为“Homo sapiens”，输入关键词“diabetes mellitus type 2”检索出与diabetes mellitus type 2相关的基因靶点.

1.3 筛选活性成分作用靶点与疾病靶点交集

通过微生信在线软件（www.bioinformatics.com.cn）筛选雾水葛活性成分-II型糖尿病靶点交集.

1.4 构建活性成分-靶点-疾病网络

使用Cytoscape软件构建活性成分-靶点-疾病网络，活性成分、靶点基因或者作用通路等可通过节点表示，将不同节点相连称为点（edge），网络中的度（Degree）表示节点之间的连接数.

1.5 构建蛋白相互作用（Protein-protein interactions，PPI）网络

在String（https://string-db.org）数据库中导入1.3中获得的雾水葛活性成分与II型糖尿病的交集靶点，选择物种为“Homo sapiens”.根据交集基因靶点的数目大小选择置信度，不低于最低置信度，利用Cytoscape软件将PPI网络可视化.

1.6 基因本体（Gene Ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析

在David（https://david.ncifcrf.gov）数据库上导入1.3中获得交集靶点，首先选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，选择物种“Homo sapiens”，最后选择列表类型“Gene List”，获取GO，KEGG相关数据，并通过微生信软件制作气泡图.

2 结果

2.1 雾水葛活性成分的筛选及基因靶点的预测

通过文献调研获取雾水葛14个活性成分，最终通过SwissADME 数据库筛选得到相关活性成分5个，如表1所示，进一步采用Swiss Target Prediction预测得到227个靶基因.

表1 通过SwissADME数据库筛选得到雾水葛5个活性成分

2.2 获取II型糖尿病相关基因

在GeneCards 数据库中检索到diabetes mellitus type 2（II型糖尿病）的相关基因有14329 个，去除重复的基因.利用Uniprot（https://www.uniprot.org）数据库对这些去重后的基因名标准化，使得数据更加准确，有利于网络图的构建及分析，最终II型糖尿病标准化的靶点共有1888个.

2.3 交互筛选雾水葛活性成分靶点与II型糖尿病相关靶点

通过微生信平台完成雾水葛活性成分基因靶点与II 型糖尿病基因靶点的交集靶点的筛选，并制作Venn图，发现雾水葛的活性成分与II型糖尿病之间有126个共同靶点，如图1所示.

图1 Venn图交互筛选雾水葛-II型糖尿病共同靶点

2.4 相关网络构建与分析

基于2.3 从微生信平台中获得的共同基因靶点126 个制作成相应的network 文件和type 文件.将相关文件依次导入Cytoscape3.9.1 软件，构建“药物-活性成分-基因靶点”网络，如图2所示.通过Cytoscape3.9.1的插件CytoNCA 计算网络中活性成分的度值，其越大表示该活性成分所调控的靶点越多，同理，作用靶点的度值越大则表示调控该靶点的活性成分越多[3].在“药物-活性成分-基因靶点”网络中按度值排名前10 位的作用靶点依次是ALOX5、ESR2、TERT、CYP19A1、AKR1B10、PTGS2、MMP2、MMP3、MMP13、TOP1、AR.这10个作用靶点可能是雾水葛活性成分治疗II型糖尿病的重要靶点.5种活性成分的度值普遍较高，其中槲皮素与芹菜素的度值都处第一，这2种成分可能是雾水葛治疗II型糖尿病的关键物质基础.

图2 雾水葛-活性成分-II型糖尿病靶点网络

2.5 蛋白相互作用（PPI）网络构建

在String数据库中导入2.3中获得的雾水葛活性成分与II型糖尿病的交集靶点，选择物种为“Homo sapiens”.由于交集基因靶点的数目较大，为了更加准确高效分析数据，选择高度置信度为0.7，进一步制作PPI网络，并利用Cytoscape3.9.1软件将PPI网络可视化，如图3所示.SRC、EGFR、MAPK3、PIK3R1、AKT1、PTPN11、ESR1、AR、TNF、PTK2 等靶蛋白处于网络的核心，推测这些靶点是雾水葛治疗II型糖尿病的重要靶点.

图3 PPI蛋白互作网络

2.6 GO及KEGG富集分析

采用DAVID 数据库进行GO 分析，发现生物学过程（BP）共有456 条，细胞学组分（CC）共有66 条，生物学功能（MF）共有133 条.将P 值倒序排列，选取P值最小的前20名条目利用微生信建立气泡图.在GO 富集分析中发现，生物学过程（BP）主要涉及细胞凋亡过程的负调节、对药物的反应及肽基-酪氨酸自磷酸化等；细胞学组分主要涉及大分子复合体、受体复合物及浆膜等；分子生物学功能（MF）主要涉及氧化应激、类固醇结合、酶结合及调节跨膜受体蛋白酪氨激酶活性等，如图4～6 所示.在KEGG 信号通路中包括HIF-1 信号通路、Phospholipase D通路、P13K-AKT通路、Relaxin通路、Estrogen 通路、Ras 通路、5-羟色胺能突触等通路，如图7所示.

图4 排名前20的生物学过程

图5 排名前20的细胞学组分

图6 排名前20的生物学功能

图7 排名前20的KEGG通路

2.7 构建疾病-通路-靶点-成分-药物网络

将126种成分疾病共有靶点、5种雾水葛的活性成分、KEGG前20条通路（根据P值由小到大排序，P＜0.05）通过Cytoscape3.9.1 构建“II 型糖尿病-通路-活性成分-雾水葛”网络，如图8 所示.II 型糖尿病的信号通路与靶点、靶点与雾水葛的活性成分之间形成非常复杂的网络关系.对“II 型糖尿病-通路-活性成分-雾水葛”网络图的拓扑参数分析，度值较前的信号通路为PI3K-Akt 信号通路，该信号通路的作用靶点为GSK3B，SYK，FLT3， FLT4， INSR， PIK3R1， EGFR，PIK3CG，PTK2，IGF1R，CDK6，ERBB2，CDK2，KDR，AKT1，TEK，MET，MAPK3.Ras信号通路的度值也偏高，其作用靶点为PLA2G1B，FLT3，FLT4，INSR，PLA2G4A，PTPN11，PIK3R1，EGFR，IGF1R，KDR，AKT1，TEK，MET，MAPK3.PI3K-Akt及Ras这两条与糖尿病密切相关的通路，其对应的靶点与网络中度值较高的靶点存在较多重合，提示雾水葛及其活性成分极有可能通过调控上述重要靶点，进而进一步影响PI3K-Akt及Ras信号通路，发挥治疗II型糖尿病的作用.

图8 “II型糖尿病-通路-靶点-活性成分-雾水葛”网络图

3 讨论

通过相关文献及数据库获取到雾水葛的活性成分5个，其中熊果酸、槲皮素、芹菜素等雾水葛活性成分被广泛用于II 型糖尿病的相关研究.熊果酸又称乌苏酸，研究表明熊果酸能对抗糖尿病及其引起的各种并发症，其可通过降脂、降糖和抗氧化作用以及对抗高浓度葡萄糖的氧化应激反应和醛糖还原酶的表达和活性，产生防治糖尿病及其并发症的作用[4-6].此外，熊果酸对II型糖尿病引起的视网膜、肝、肾及心肌损伤均有明显的保护作用[7-12].研究发现槲皮素可改善糖尿病大鼠的糖代谢，抑制胰岛β细胞氧化应激，减少胰岛β细胞凋亡，并促进胰岛β细胞的胰岛素分泌，其还可抑制糖尿病大鼠炎症反应，减少脊髓背角神经细胞凋亡，促进神经传导，减轻疼痛症状[13-16].此外，槲皮素可以改善由糖尿病引起的视网膜组织氧化应激损伤、神经病理性疼痛、及肾脏损伤[17-20].芹菜素又称洋芹素，诸多研究显示其对于治疗糖尿病及其并发症具有良好的效果.芹菜素可通过减少抗氧化应激、保护胰岛β细胞线粒体膜、增加胰岛素敏感性、激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ及改善心肌梗死后血流动力学紊乱等途径发挥降血糖作用，同时对糖尿病引起的氧化应激损伤、心肌损伤等其他糖尿病并发症均有较好的治疗作用[21-23].

通过预测雾水葛活性成分的作用靶点共有227个，与II型糖尿病相关的靶点共有1888个，其中雾水葛活性成分与II型糖尿病的交集靶点共有126个.通过对网络图的拓扑参数分析，其中度值较高的基因靶点包括MAPK3、EGFR、AKT1、PIK3R1及IGFIR 等.由GO 分析的结果可知，雾水葛治疗II 型糖尿病主要涉及的生物过程有对细胞凋亡的负调节、肽酪氨酸自磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的正向调节等；细胞学组分主要涉及大分子复合体、受体复合物及浆膜等；其分子功能涉及氧化应激、调节蛋白酪氨酸激酶活性及酶结合等.由KEGG分析可知，其信号通路中主要涉及HIF-1信号通路、P13K-AKT通路及Ras通路等通路.

PI3K/Akt信号通路是胰岛素在肝脏中发挥作用的主要信号通路，PI3K/Akt信号通路的活化通常有两种路径，一种是Ras直接与pll0结合而引发PI3K活化Edgar KA，另一种是与具有酪氨酸残基的受体或蛋白相互作用激活[24-25].胰岛素抵抗是II型糖尿病发病机制之一，PI3K/Akt信号通路障碍及下游靶蛋白功能异常均可引发糖、脂代谢障碍，继而导致胰岛素抵抗的发生[26].根据GO分析，雾水葛及其靶基因的生物学过程中涉及氧化应激，而HIF-1信号通路可减少胰岛β细胞的凋亡，减弱机体对氧化应激的反应，来维护胰岛β细胞的正常功能[27].在分子生物功能及生物过程中都涉及了富集较高的磷酸酪氨酸结合、蛋白酪氨酸激酶活性及非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶活性.受体酪氨酸激酶的活性降低会导致受体跨膜信号障碍，也会直接引起人体胰岛素抵抗[28].

4 结论

雾水葛中的活性成分熊果酸、槲皮素及芹菜素等，可能通过作用于INSR、ERBB2、AKT1、TEK、PIK3R1、EGFR、IGF1R、MAPK3等重要靶点，进一步调节PI3K/Akt及HIF-1信号通路，从而影响与糖尿病密切相关的氧化应激、胰岛β细胞凋亡、胰岛素抵抗等生物过程，发挥治疗II型糖尿病的作用.本研究为雾水葛治疗II型糖尿病的临床应用提供理论基础.