基于网络药理学及分子对接技术探讨柏子养心丸治疗失眠症的作用机制

马贝贝，田颖颖，杨海润，王婷婷，张志聪，杨硕，曹欣垚，左泽平*，王志斌*

1.北京同仁堂股份有限公司科学研究所，北京 100079

2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488

睡眠作为一种与人类健康息息相关的重要生理活动，有益于神经系统的能量储存与恢复，辅助机体学习记忆行为的顺利完成[1]。近年来失眠症已成为临床最为常见的睡眠障碍[2]，持续的睡眠启动与维持困难导致的睡眠质量和时间无法满足日间需求的主观体验使大部分患者长期遭受焦虑、头痛、间歇性遗忘等症状的困扰[3]，并时刻暴露于罹患抑郁、心脏病、高血压、肥胖的风险之下[4]。据世界卫生组织报告，全球约1/3 的普通人群患有持久性睡眠障碍，约有50%个体一生中均会经历失眠症状[5]。现今医学界常用的失眠症治疗药物主要包括苯二氮类、三环类抗抑郁药及褪黑素等，虽可发挥诱导催眠效果，但频繁使用会引发呼吸抑制、肾功能损害、反弹性失眠及戒断反应等，一些药物如氯硝西泮和格鲁米特甚至会导致认知功能丧失[6]。中医药作为一种备受推崇的补充与替代医学手段可为失眠症医治提供可靠的选择方案。

柏子养心丸作为一类传承源远、应用广泛、普遍认可的中医经典名方，首载于明代医家彭用光所著的《体仁汇编》中，而后在《古今医统大全》《景岳全书》及《汤头歌诀》等诸典籍中多有出现，现今被收录于《全国中药成药处方集》《中华人民共和国药典》2020 年版一部及《国家基本药物目录》中。柏子养心丸全方具有补气、养血、安神之功，适用于心血亏损、怔忡惊悸、失眠健忘、盗汗多梦等症候，临床多用于治疗心脾两虚型失眠、慢性焦虑症及心律失常等。据报道，柏子养心丸可明显延长戊巴比妥干预小鼠的睡眠时间，增加其睡眠动物数（入睡率）[7]。此外，柏子养心丸联合参芪五味子片、归脾汤及穴位针刺等治疗各种失眠症疗效均显著[8]。但目前国内外学术界尚未有柏子养心丸作用机制研究的相关报道，且其质量标志物鲜有探讨，这将严重阻碍其质量标准建立与临床应用推广。

网络药理学是一种源于系统生物学、多重药理学和分子网络的新方法[9-10]，“网络靶点”作为其核心概念可从生物网络角度分析中药方剂的药效物质基础，运用现代生物信息学技术指导中药质量标志物的发现，剖析多组分药物在生物体内的作用机理，从分子水平整体阐释疾病、人类生物系统和药物靶标之间的复杂关系[11]，这正与中医药“多靶点、多途径调控”及“整体辨证论治”的理论观念相一致，从而成为全面、系统解析中药复方作用机制的强大工具，由此被广泛应用于各类中医药经典方剂的有效成分确定、潜在靶点识别及干预通路挖掘。分子对接是一种基于计算机智能模拟工具预测分子与蛋白质之间的相互作用、结合模式及亲和力的药物辅助设计和筛选技术，其结果准确，成本低廉，已被逐渐用于中药方剂的活性成分评价研究。因此，本研究通过整合网络药理学方法与分子对接技术对柏子养心丸的活性成分、调控靶标及作用机制进行多层次、多维度的全面探索，旨在明确其作用靶点，确认其质量标志物，为下一步的功效通路精准定位及质量评价体系构建提供科学参考。

1 资料与方法

1.1 柏子养心丸的活性成分筛选及靶点收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索柏子养心丸整方中柏子仁、党参、黄芪、川芎、当归、茯苓、远志、酸枣仁、肉桂、五味子、半夏、甘草、朱砂13 味药材的化学成分，以生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18为界定值筛选活性化合物，并搜集其调控靶点，而后利用Uniprot 数据库对所有靶点基因进行ID 名称规范。

1.2 失眠症的治疗靶点收集

以“insomnia”“dyssomnia”“sleep disorder”等与失眠症定义相关的专业术语为关键词，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/，Relevance score值≥1）、OMIM数据库（https://omim.org/）、PharmGKB 数据库（https://www.pharmgkb.org/）、TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd/）检索失眠症关联调控基因，同时进入DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com/）搜寻并整理用于失眠症治疗的临床一线药品作用靶点作为重要补充，合并以上5 个数据库的靶点信息，剔除重复基因后即为失眠症的治疗靶点库。

1.3 柏子养心丸活性成分-失眠症治疗靶点蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

以柏子养心丸活性成分的调控靶点及失眠症的治疗靶点库为基础，使用R 语言程序包“venn”将二者取交集并绘制韦恩图，并进一步将交集靶点上传到STRING 数据库（https://string-db.org/）进行蛋白相互作用分析，设定“Organisms”为“Homo sapiens”，设定“minimum required interaction score”为0.9，生成的PPI 网络图导入到Cytoscape 3.9.1 软件中，利用CytoNCA 工具计算各网络节点的连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closeness）等参数，以R 语言程序对每个参数进行中位值过滤循环，寻找PPI 网络中的核心靶点，并基于此构建PPI 核心作用模块。

1.4 柏子养心丸治疗失眠症作用靶点功能与通路的富集分析

使用R 语言中的“BiocManager”平台加载“org.Hs.eg.db”程序包，并将以上所述的柏子养心丸活性成分作用靶点与失眠症治疗靶点库的交集靶点基因symbol 名称转换为entrezID，而后再采用R语言“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”等程序包对交集基因进行基因本体（GO）功能富集与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设置P值过滤条件为0.05，选取GO 富集结果中生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3 个模块各前10 个基因功能集合及KEGG 富集结果中前30 条通路以条形图（barplot）和气泡图（bubble）的形式进行可视化。

1.5 柏子养心丸活性成分-治疗失眠症作用靶点网络图的构建

使用Cytoscape 3.9.1 软件将柏子养心丸治疗失眠症的作用靶点（交集靶点）与其关联的活性化合物的相互关系绘制成网络图，并采用内置的CytoNCA 工具分析整个网络中成分与靶点各个代表节点的度、介度及紧密度，根据网络拓扑学参数探讨柏子养心丸治疗失眠症的关键药效成分与核心作用靶点。

1.6 柏子养心丸关键成分与核心靶点的分子对接验证

将分析得到的柏子养心丸关键药效成分导入PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索，下载其2D 结构后使用ChemOffice 套件中的Chem3D 软件转换为3D 结构；同时，结合Uniprot 数据库查询到的核心靶点的“Entry Identifier”进一步搜索RCSB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载其三维空间结构，使用开源Pymol 软件删除其中的水分子与有机小分子，而后导入AutoDockTools 1.5.7 软件进行加氢、加电荷操作，设置Gridbox 参数确定对接范围，最后采用AutoDock Vina 1.1.2 软件进行分子对接验证，根据配体-蛋白对接模型的最低结合能判断成分与靶点的亲和能力，使用Pymol 软件将对接结果可视化。

1.7 柏子养心丸关键活性成分与潜在靶点的二次挖掘

为了避免在网络药理学生物信息筛选过程中出现潜在活性成分与调控靶点的遗漏现象，本研究再次以PPI 核心作用模块中的关键靶点为源头，反向追溯其关联的柏子养心丸化学成分，并使用Pymol、AutoDockTools 1.5.7、AutoDock Vina 1.1.2系列软件对这些化合物与核心靶点进行分子对接考察，根据结合能的大小确定潜在的活性成分与作用靶点，以期更全面阐释柏子养心丸治疗失眠症的作用途径，补充完善其质量标志物。

2 结果

2.1 柏子养心丸活性成分与靶点的筛选

利用TCMSP 数据库初步提取并经ADME 筛选后共得到柏子仁化学成分5 种，半夏化学成分13种，川芎化学成分7 种，当归化学成分2 种，党参化学成分21 种，茯苓化学成分15 种，甘草化学成分92 种，黄芪化学成分20 种，酸枣仁化学成分9种，合并后共得到167 个活性化合物，见表1。进一步收集其相关作用靶点，合并后共得264 个调控基因。

表1 柏子养心丸中的活性成分Table 1 Active ingredients in Baizi Yangxin Pills

2.2 失眠症疾病相关靶点的获取

从GeneCards 数据库收集疾病靶点323 个，从TTD 数据库收集疾病靶点26 个，同时结合OMIM与PharmGKB 数据库搜集结果补充相关靶点，最后，从DrugBank 数据库收集用于失眠症治疗的临床一线药物治疗靶点178 个。合并以上5 个数据库的搜集结果，剔除重复基因，共计得到失眠症干预靶点475 个，各数据库靶点的收集合并情况见图1。

图1 失眠症相关靶点Fig.1 Related targets of insomnia

2.3 柏子养心丸作用靶点-失眠症基因PPI 网络分析

使用R语言平台将收集到的柏子养心丸调控靶点与失眠症基因取交集，绘制韦恩图，见图2，获得二者的共同靶点69 个。将共同靶点上传到STRING 平台绘制PPI 网络，见图3。为了更准确剖析柏子养心丸治疗失眠症的潜在分子机制，将PPI 网络导入Cytoscape 3.9.1 软件进行节点区分与区域可视化，采用内置的CytoNCA 工具计算各节点的degree、betweenness、closeness 参数，以R 语言程序对每个参数进行中位值过滤循环，发现PPI网络中的核心靶点包括丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK3）、CXC 型趋化因子配体8（CXCL8）、细胞色素P450 3A4 酶（CYP3A4）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、细胞色素P450 家族成员1A1（CYP1A1）等，PPI 核心互作模块见图4。

图2 柏子养心丸作用靶点与失眠症基因交集韦恩图Fig.2 Venn diagram of the intersection between the targets of Baizi Yangxin Pills and insomnia genes

图3 柏子养心丸-失眠症交集基因的PPI 网络Fig.3 PPI network of Baizi Yangxin Pills-insomnia intersection genes

图4 PPI 网络中关键靶点的剖析与核心PPI 模块的构建Fig.4 Anatomy of key targets in PPI network and construction of core PPI modules

2.4 GO 功能与KEGG 通路的富集分析

使用R语言平台对柏子养心丸治疗失眠症的作用靶点进行GO 功能与KEGG 通路富集分析，结果显示，柏子养心丸主要参与的BP 主要为对外源性刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对养分水平的响应（response to nutrient levels）等；MF主要富集在G 蛋白偶联胺受体活性（G protein coupled amine receptor activity）、神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、突触后神经递质受体活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）等；CC 主要存在于突触膜（synaptic membrane）、突触后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）等。

参与调控的通路主要涉及神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand receptor interaction）通路、神经退行性变-多种疾病通路（pathways of neurodegeneration multiple diseases）、化学致癌-受体激活（chemical carcinogenesis receptor activation）通路等，见图5。

图5 柏子养心丸调控失眠症作用靶点的GO 富集分析和KEGG 通路分析Fig.5 GO enrichment analysis and KEGG pathway of the action targets of Baizi Yangxin Pills in regulating insomnia

2.5 柏子养心丸活性成分-调控失眠症靶点网络图分析

采用Cytoscape 3.9.1 软件构建柏子养心丸活性化合物调控失眠症基因的网络图，见图6。通过Cytoscape 软件内置CytoNCA 工具对该网络图进行网络拓扑学分析，以各节点的degree、betweenness及closeness 为参数进行筛选，发现柏子养心丸治疗失眠症的关键药效成分主要包括槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等，见表2。柏子养心丸干预失眠症的主要靶点为前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、环加氧酶 1（PTGS1）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）、肾上腺素能受体β2（ADRβ2）、α1 肾上腺素能受体B（ADRA1B）、乙酰胆碱酯酶（AChE）及毒蕈碱型胆碱受体M1（CHRM1），见表3。

图6 柏子养心丸活性成分-失眠症调控靶点网络图Fig.6 Network image of the active ingredients in Baizi Yangxin Pills and insomnia regulatory targets

表2 柏子养心丸调控失眠症的关键药效成分Table 2 Key medicinal ingredients of Baizi Yangxin Pills for regulating insomnia

表3 柏子养心丸调控失眠症的核心作用靶点Table 3 Core targets of the Baizi Yangxin Pills in regulating insomnia

2.6 分子对接验证

将从“柏子养心丸活性成分-失眠症靶点网络图”中分析得到的关键药效成分与核心作用靶点进行分子对接验证，以结合能的大小评价活性分子与靶点蛋白结合能力，结合能≤-7 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）时表明二者有较强的结合力。结果显示，7 个关键药效成分与9 个核心靶点均有较好的结合活性，进一步说明柏子养心丸的关键活性成分对失眠症的核心调控靶点有较强的亲和力，由此在失眠症的干预过程中发挥“多成分-多靶点-多途径”的治疗效果。“成分-靶点”的分子对接结果见表4，活性成分与靶点蛋白结合形成的代表性稳定构象见图7。

图7 柏子养心丸关键药效成分与核心靶点的代表性对接构象Fig.7 Representative docking conformations of key pharmacodynamic components of Baizi Yangxin Pills and core targets

表4 柏子养心丸活性成分与核心靶点的结合能力Table 4 Binding ability of the active ingredients of Baizi Yangxin Pills to the core targets

2.7 潜在活性化合物与作用靶点的二次挖掘

为了更全面、准确、深度剖析柏子养心丸的质量标志物与体内作用机制，本研究使用PPI 网络核心互作模块中的关键靶点反向追溯其关联的活性化合物，而后进一步施行分子对接结合力考察，以多层次挖掘潜在的药效成分与治疗靶点。结果显示，除柚皮素、槲皮素、山柰酚外，木犀草素与黄芩素亦为柏子养心丸潜在的活性组分，见表5。且根据“成分-靶点”的结合力可判别出MAPK3、CXCL8、CYP19A1、CYP3A4、CYP1A1、HIF1A、VEGFA 为柏子养心丸治疗失眠症的潜在调控靶标，由此对接生成的稳定分子构象见图8。

图8 PPI 网络核心靶点与其关联成分对接的分子构象Fig.8 Molecular conformations of the core targets of the PPI network docked with their associated components

表5 PPI 网络核心靶点与关联成分的结合能力Table 5 Binding capacity of core targets of PPI network with associated components

3 讨论

失眠症在中医古籍中多以“不寐”“不瞑”“不得眠”“不得卧”等症候词出现[12]。《景岳全书》有云：“神安则寐，神不安则不寐，劳倦思虑太过者，必致血液耗亡，神魂无主，所以不眠。”《素问》又云：“胃不和，则卧不安。”《类经》曾指出：“凡人之寤寐，由于卫气，卫气者，昼行于阳，则动而为寤；夜行于阴，则静而为寐，”又言：“思虑伤脾，脾血亏虚，经年不寐。”《灵枢》记载曰：“卫气不得入于阴，常留于阳，故目不瞑。”《太平圣惠方》述曰：“夫胆虚不得睡者，是五脏虚邪之气干淫于心。心有忧恚，伏气在胆，所以睡卧不安。心多惊惧，精神怯弱，盖心气忧伤，肝胆虚冷，致不得睡也。”由此可见，失眠症在中医理论下解析的病因多在于营卫失和、情志内伤、饮食不调、脏腑损伤、气血亏虚、心神失养等[13]。柏子养心丸全方共13 味药材，其中柏子仁养心安神，党参健脾益肺、养血生津；黄芪益气补中；川芎活血行气；当归补血活血；茯苓健脾宁心；远志安神益智、交通心肾；酸枣仁养心补肝、宁心安神；肉桂补火助阳、温经通脉；五味子益气生津、补肾宁心；半夏曲燥湿和胃化痰；朱砂清心镇惊、安神明目；炙甘草补脾和胃、益气复脉又可调和诸药，全方共奏补气、养血、安神之功，且与“不寐”之病机逐一相符，因而成为医治失眠症的经典名方。

通过网络药理学分析、拓扑学参数计算及潜在活性成分的二次挖掘，槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩素、柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇及7-甲氧基-2-甲基异黄酮被确定为柏子养心丸的有效成分，各个成分在筛选过程中即可追溯相应原药材归属，且与多个核心靶点具有良好的对接活性，来源方剂配伍理论牢靠，为柏子养心丸专有且可进行定性定量检测，符合刘昌孝院士关于中药Q-Maker“有效性”“特有性”“质量传递与溯源”“可测性”“配伍环境”所阐释的科学内涵[14]。据报道，槲皮素可明显缩短失眠模型小鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠时间，可使白细胞介素-6（IL-6）、γ-氨基丁酸（GABA）和γ-氨基丁酸受体亚基α1（GABRA1）的mRNA 表达显著增加[15]。此外，槲皮素还可通过CYP1A 途径抑制褪黑素在大鼠肝微粒体中的代谢消除[16]。山柰酚通过调节GABA 能系统可增强戊巴比妥诱导的小鼠睡眠行为[17]。木犀草素能降低睡眠剥夺大鼠海马区的热休克蛋白（HSP）90 表达，增加HSP70 表达，以剂量相关方式恢复睡眠剥夺所致的空间记忆障碍[18]，可通过与腺苷A1 及A2A 受体结合发挥催眠作用[19]。将黄芩素注射到大鼠的中枢神经系统可延长乙醚诱导的睡眠持续时间，且具有良好的抗焦虑和镇静作用[20]。柚皮素可改善睡眠剥夺并发症大鼠的记忆和情绪，减少脑组织细胞凋亡，且可有效缓解依法韦仑所诱导的睡眠障碍[21]。β-谷甾醇可延长睡眠诱导与睡眠干扰模型小鼠的睡眠时间，降低睡眠潜伏期，增加脑组织内的褪黑素受体1 和2 的mRNA 表达，促进细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2和αCaMKⅡ的磷酸化[22]。豆甾醇可显著升高小鼠下丘脑γ-氨基丁酸水平，降低谷氨酸含量，镇静催眠作用优良。以上研究报告为基于“物质-功能”理论确定柏子养心丸的质量标志物提供了充足的科学依据。

通过“活性成分-调控靶点”网络与PPI 网络的构建分析，PTGS2、ESR1、PPARG、PTGS1、GSK3β、ADRB2、ADRA1B、AChE、CHRM1 等基因被确定为柏子养心丸治疗失眠症的核心调控靶点，MAPK3、CXCL8、CYP19A1、CYP3A4、CYP1A1、HIF1A 及VEGFA 为柏子养心丸的潜在作用靶标。据报道，在急性异相睡眠剥夺过程中，小鼠前额叶皮层富集在TNF 信号通路中的关键基因PTGS2 上调[23]。ESR1 基因在调节失眠对围绝经期和绝经后妇女认知功能的影响中发挥着重要作用[24]，其甲基化比例增加与睡眠障碍显著相关[25]。PPARG 基因与中国汉族人群中阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的发病率存在明显关联[26]。PTGS1 为皮层及海马组织中的主要炎性反应介质，可介导炎症反应参与睡眠调节[27]。GSK-3β 参与情绪与昼夜节律调节，是干预睡眠-觉醒周期和昼夜运动行为的重要基因[28]。在阿尔茨海默病的斑马鱼模型中，短长度的Aβ 寡聚体可通过ADRB2 受体诱导急性觉醒，进而导致动物的睡眠活动紊乱[29]。对大鼠进行异相睡眠剥夺72 h 后，脑组织中的AChE 活性显著地增加[30]，而通过修复胆碱能系统功能（抑制AChE 表达）可治疗失眠[31]。CHRM1 被认为是调节快速眼动睡眠的一个至关重要基因[32]。MAPK3 是MAP 激酶信号转导通路的重要组成部分，其磷酸化与睡眠持续时间密切相关，且睡眠剥夺会减少海马体中MAPK3 的表达损害记忆[33]。CXCL8 在重度阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者中表达异常，并导致免疫反应与细胞因子-受体信号通路的改变[34]。CYP19A1 是中枢神经系统中一种不可或缺的酶，可催化雌激素合成，而雌激素在维持大脑稳态和功能方面起着重要作用[35]。CYP1A1 的活性升高可导致苯巴比妥诱导小鼠的睡眠时间减少[36]。HIF1A 是褪黑素合成相关信息传递过程中一种重要的昼夜节律基因[37]，可介导睡眠过程中间歇性缺氧发生[38]。VEGFA 是一种与血管生成和神经发生相关的神经营养因子，可影响突触可塑性，并参与睡眠周期调节[39]。由此可知，经多维分析所挖掘的柏子养心丸作用靶点均与失眠的分子机制关联紧密。

本研究充分整合网络药理学方法与分子对接技术，对失眠医治古方柏子养心丸的核心活性成分与主要作用靶标进行了多层次反复挖掘与精准识别，确认了9 个有效成分、9 个关键作用靶点与7个潜在作用靶点。经过文献检索与信息收集，各个质量标志物与作用靶点均与睡眠障碍息息相关。通过GO 功能与KEGG 富集分析发现，柏子养心丸调控失眠涉及的生物学过程如外源性刺激的反应、对养分水平的响应、氧化应激反应等。因此，未来针对柏子养心丸的研发除却推进质控方法建立与质量标准体系优化外，还应结合多种心脑血管疾病与代谢类疾病整体研判疗效，以此为基础进行靶点验证、通路定位、基因网络绘制、体内小分子或大分子代谢扰动等干预分子机制的深入探索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突