超声分子探针在肿瘤精准治疗中的应用进展

武志慧，曲妮娜，曹小丽

1 滨州医学院医学影像学院，山东烟台264003；2 烟台毓璜顶医院超声医学科

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病。根据WHO下属的国际癌症研究机构发布的最新统计数据，2020年全球新增恶性肿瘤病例约1 930万例，死亡病例约1 000万例［1］。手术、化疗和放疗是恶性肿瘤传统的治疗手段，尽管这些治疗手段不断进步，但其疗效并未达到同等程度的预期，在临床上仍存在一系列问题，如手术治疗创伤大，放化疗全身毒性作用明显，并且大多数化疗药物缺乏靶向性和特异性、易产生获得性多药耐药等。因此，寻找疗效高、副作用小且靶向性强的治疗方法一直是众多研究者所关注的问题。精准诊疗集合了现代科技手段与传统医学方法，科学地认识人体机能与疾病本质，系统地优化人类疾病防治和健康促进原理与实践，是以高效、安全、经济为特点的新型健康医疗服务范式。精准医疗能够在疾病早期精准诊断，从而有针对性地选择相应的治疗方式或药物，最终实现肿瘤的精准治疗和疗效评估［2］。超声分子探针作为一种兼具超声成像和治疗的新型诊疗剂，它既可提高肿瘤诊断的准确度和灵敏度，又能作为目的基因或药物载体发挥超声靶向递送作用，在低强度超声作用下产生一系列生物学效应，从而介导药物递送、基因转染、组织屏障开放、免疫治疗等，为精准治疗打下坚实基础，实现肿瘤早期诊断、靶向治疗和疗效评价于一体的“一站式精准诊疗”模式。本文结合文献就超声分子探针在肿瘤精准治疗中的应用进展作一综述。

1.声分子探针发展历程及其作用机制

超声分子探针是一类能够显著增强超声背向散射强度的化学试剂，这一技术将超声诊断带入分子影像学研究领域，在肿瘤精准诊疗中扮演重要角色。然而，超声微泡造影剂作为最初的超声分子探针，无法透过血管壁有效聚集在肿瘤组织内部（“大不过”），存在一定局限性。之后发展出现的靶向纳泡，虽然能够使大分子颗粒轻易穿透疏松的肿瘤血管到达肿瘤组织［3］，但因其粒径小于1 000 nm，相应的超声回波信号也大大降低（“小不强”）。近年来，兼具两者优点的相变型超声分子探针应运而生，以液态氟碳纳米颗粒最具代表性。液态氟碳纳米颗粒由脂质壳和液核组成，纳米粒径可使分子探针通过“高渗透长滞留”效应渗透到靶组织，随后在一定能量的超声辐照下，液核汽化形成微泡，实现“大可过，小可强”，不仅可改善靶组织的成像效果，还可将负载药物释放到靶区，有效提高局部药物浓度，从而杀灭肿瘤细胞［4］。超声分子探针的载药方式主要包括三种：①将药物封装在探针壳膜内部；②药物通过静电作用或生物素-亲和素连接装载在壳上［5］；③通过配体-受体相互作用将药物封装成纳米材料连接到探针外壳。此外，多功能分子探针还可联合递送两种或多种药物，从而达到抗肿瘤药物联合治疗的目的。

超声分子探针除了自身的巨大优势外，与低强度超声联合还能产生一系列生物学效应，发挥超声靶向递送作用。空化效应是超声靶向递送的重要机制之一。当超声在介质中传播时，其内的微小空化核发生振荡、膨胀和塌陷等一系列动力学过程，由此产生的微射流和剪切力会破坏空化核周围的血管壁和细胞膜［6］。超声分子探针作为人造空化核进入机体后可显著增强这一效应。在适当强度超声作用下，细胞膜电位发生变化，增强了自身内吞作用，从而促进药物摄取，同时导致内皮细胞之间的缝隙连接打开，在细胞膜上形成瞬时微孔，这一现象被称为声孔效应。在不损害组织生理屏障和防御机制的情况下，声孔效应引起的细胞膜渗透是可逆的，细胞膜通常在几秒钟内即可恢复至其原始构象［7］。当超声强度超过空化阈值时，空化核产生的冲击波和瞬时剪切力对细胞产生强烈冲击和热效应，导致细胞膜结构改变和破坏，形成永久开放小孔。当相变型纳米颗粒受到超声刺激时，液核内部压力降低，可迅速发生规律的蒸发、膨胀，形成比原来液滴大5～6倍的微气泡，这一过程被称为声学液滴蒸发［8］。相较于传统微泡载体，声学液滴蒸发的穿透力和稳定性更强，能够通过肿瘤微环境的“高渗透长滞留”效应将装载药物递送到肿瘤组织，使药物在靶组织内积聚，进而提高治疗效果。

2.声分子探针在肿瘤精准治疗中的应用

超声分子探针具有非侵入性和靶向性优点。低强度超声能够改变细胞膜的结构，增加其通透性。两者联合能够介导治疗药物在肿瘤靶区特异性释放、血脑屏障开放，还能够使超声分子探针作为载体和免疫增强剂携载目的基因进行基因转染，介导肿瘤基因治疗和免疫治疗，在肿瘤精准治疗中发挥重要作用。

2.1.导药物递送 在化疗中存在肿瘤部位药物利用率低和毒副作用大等不足。超声分子探针在低强度超声辐照下与低剂量药物联合应用，能够使药物穿过肿瘤组织的血管壁间隙，到达肿瘤细胞内部，从而增加药物的靶向利用率和细胞毒性，同时还减少了药物全身毒副作用并提高对化疗的耐受性。ZHANG等［9］通过cRGD肽和cCLT1肽分别靶向选择整合素和纤维连接蛋白，将其修饰在包封紫杉醇的微泡上形成双靶向PTX-RCMBs，与低强度超声联合能够增强肿瘤血管的通透性，显著增加紫杉醇在肿瘤组织的释放，从而抑制肿瘤生长。有研究发现，缺氧会阻碍肿瘤细胞的药物摄取并降低化疗药物的细胞毒性，从而导致缺氧诱导性耐药［10］。YANG等［11］研究表明，负载混合气体的脂质微泡（O2∶C3F8为5∶1）联合低强度超声可将乳腺肿瘤中的氧分压提高近6倍，从而显著改善肿瘤缺氧微环境，抑制肿瘤生长。因此，低强度超声联合脂质微泡不仅能增强抗肿瘤药物的靶向释放，还能调节肿瘤缺氧微环境，抵抗肿瘤细胞的耐药性。

2.2.导血脑屏障开放 血脑屏障是大脑中的一种天然屏障，可防止病毒、炎症因子和免疫细胞等进入脑实质。通常血脑屏障仅允许小于400 Da的营养素和脂溶性分子通过，而大分子和水溶性分子无法通过，这会阻碍药物进入颅内，限制颇内肿瘤的药物治疗效果。低强度超声是一种可控的实现血脑屏障开放的有效方法，在超声分子探针定位下具有提高颅内局部药物浓度的能力。超声靶向给药技术通过声孔效应扩大血脑屏障中内皮细胞之间的缝隙，以促进药物高效靶向运输至颅内病灶区域，实现局部无损伤、可逆性的血脑屏障开放，而且不会引起严重的神经元损伤［12］。ZHANG等［13］研究表明，与单独用药相比，装载紫杉醇的微泡经过超声介导，渗透至大脑中的药物剂量可提高3～5倍。YAN等［14］将姜黄素包封在脂质PLGA-NBs核内，联合低强度超声可打开血脑屏障，增加姜黄素渗透至病变脑组织，从而显著提高疗效。

2.3.导肿瘤基因治疗 基因治疗是一种通过改变个体的基因表达来治疗疾病的方法，可为肿瘤提供全新的治疗策略。肿瘤基因治疗可将治疗性基因转染至肿瘤细胞，也可使用病毒或非病毒载体传递基因选择性沉默癌基因。病毒载体转染效率高，但其安全性是临床试验的主要障碍。非病毒载体的脂质体转染不存在免疫原性问题，但其靶向性差和稳定性欠佳［15］。超声分子探针能够精确且无创地将治疗性遗传物质（如寡核苷酸和质粒DNA）递送至靶位点，从而提高转染效率并限制非靶向转染。

2.3.1.因转染 超声分子探针介导的基因治疗具有低免疫原性、非侵袭性、靶器官高度特异性等特点。低强度超声通过声孔效应使局部毛细血管和邻近组织细胞膜产生一过性小孔，细胞膜的通透性增加，介导携带特定基因的超声分子探针内吞，从而改善基因的转染和表达，提高基因治疗的靶向性。因此，超声分子探针介导的靶向递送是一种安全高效的新型基因转染技术。LIU等［16］研究表明，与单独使用专制的纳米液滴相比，使用超声与纳米液滴联合转染DKK-2基因可获得较高的转染效率，从而抑制前列腺癌生长。WANG等［17］提出将miR-122封装到纳米颗粒中，经超声辐照组肿瘤组织miR-122表达比未经超声辐照组高7.9倍，转染效率显著提高。ZHAO等［18］设计了多功能FOXA1卟啉微泡，通过低强度超声辐照后显著增加了MCF-7细胞中siRNA的转染效率和卟啉的摄取率，有效抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞增殖。

2.3.2.NA干扰 RNA干扰是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因的表达。血管内皮生长因子（VEGF）、生存素（Survivin）均与肿瘤的发生、发展有关，是RNA干扰的首选靶点。向肿瘤中递送siRNA能够靶向抑制mRNA并下调其蛋白表达，但裸siRNA的细胞摄取较差，容易被血清中的核糖核酸酶降解。超声分子探针包裹裸siRNA联合低强度超声通过空化效应能够显著提高其转染效率，高效靶向抑制促癌基因的表达，是一种高效的基因沉默方法。SU等［19］制备了携载PDLIM5 siRNA的新型阳离子脂质纳泡，与低强度超声联合转染PDLIM5 siRNA，可显著增加肿瘤组织siRNA摄取，达到更佳的基因沉默效果，从而显著抑制肿瘤生长。ZHANG等［20］构建LHRHa靶向微泡和Survivin基因的shRNA重组质粒，联合低强度超声介导shRNA转染以抑制Survivin基因表达，可有效提高细胞凋亡率和细胞增殖抑制率。

2.4.导肿瘤免疫治疗 在肿瘤微环境中，细胞通过不同方式逃避免疫系统的监视并抑制机体免疫系统，从而介导肿瘤免疫逃逸。肿瘤免疫治疗是通过肿瘤疫苗、单克隆抗体、细胞因子、免疫细胞等主动或被动方法，刺激机体免疫系统选择性地攻击和对抗肿瘤细胞，从而抑制或消除肿瘤细胞。免疫疗法包括主动免疫疗法和被动免疫疗法。主动免疫疗法主要刺激自身免疫系统消除肿瘤细胞，而被动免疫疗法则是向机体输注外源性免疫效应物质，由这些外源性免疫效应物质发挥抗肿瘤作用。传统免疫治疗通常采取静脉注射，存在靶向性差且治疗有效率低等问题，而超声与分子探针联合应用可显著提升免疫治疗效果。

2.4.1.瘤疫苗免疫治疗 肿瘤疫苗免疫治疗是向机体输入抗原性肿瘤疫苗，通过触发机体自身免疫系统，刺激产生特异性抗肿瘤免疫，从而达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。树突状细胞（DC）疫苗和DNA疫苗是最常见的肿瘤疫苗。DC能够高效地摄取、加工和呈递抗原，促进抗原特异性T细胞免疫应答。DEWITTE等［21］设计了一种载有肿瘤抗原和免疫抑制剂TriMix mRNA的微泡，并与低强度超声联合触发DC转染，诱导抗原特异性T细胞产生，能够引起抗原表达细胞死亡。DNA疫苗利用外源性肿瘤相关基因编码肿瘤抗原，从而激活免疫反应，具有良好的稳定性和安全性。YOSHIDA等［22］使用甘露糖修饰基因载体和载阿霉素的聚乙二醇修饰脂质体微泡联合低强度超声观察DNA疫苗的抗肿瘤效果，发现该方法能够显著提高抗原提呈细胞的转染效率，特异性激活细胞毒性T淋巴细胞，从而提高治疗效果。

2.4.2.克隆抗体免疫治疗 单克隆抗体是仅针对某一特定抗原表位的抗体，通过阻断特定分子靶点治疗肿瘤。例如，曲妥珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体，能够降低HER2阳性乳腺癌的复发风险，显著延长患者生存时间，但其全身毒副作用明显。KOBUS等［23］将来自乳腺癌脑转移瘤的HER2阳性细胞接种至裸鼠脑内，应用超声联合微泡介导血脑屏障开放，可增加曲妥珠单抗和培妥单抗在脑肿瘤中的积累，显著抑制乳腺癌脑转移瘤生长。

2.4.3.继免疫治疗 过继免疫治疗是取自体淋巴细胞经体外激活、增殖后再输回体内，以杀伤或清除体内肿瘤细胞。NK细胞是目前常用的过继细胞之一，可对肿瘤细胞产生天然免疫反应，但传统方法将大量过继细胞回输时会引起发热、过敏反应等副作用。ALKINS等［24］研究表明，超声微泡介导的NK细胞能够靶向至肿瘤部位，对肿瘤细胞产生更强的细胞毒性，从而延缓肿瘤生长，提高荷瘤大鼠生存期。

2.4.4.胞因子免疫治疗 细胞因子免疫治疗是将细胞因子高浓度输送至目标靶区，以诱导强有力的抗肿瘤免疫反应。细胞因子主要调节免疫反应和炎症反应。IL-12在触发抗肿瘤免疫反应和建立抗宿主肿瘤复发的长期免疫记忆方面效果显著，但其剂量受全身免疫毒性的限制。CHEN等［25］研究报道，超声靶向微泡可诱导血脑屏障开放，促使IL-12向大脑递送，激活局部免疫反应，从而增强其抗肿瘤作用。

综上所述，超声分子探针能够向肿瘤细胞高效靶向递送治疗性物质，通过低强度超声的空化效应增强肿瘤细胞的通透性，提高抗肿瘤物质的转染效率，介导肿瘤靶向治疗和免疫治疗，促进肿瘤精准诊疗水平飞速提升。但在临床应用中仍面临诸多挑战，如可控性、可重复性，并且靶向性和稳定性也有待于进一步提高。相信随着分子影像学的进一步发展和超声分子探针性能的不断改善，超声分子探针在肿瘤精准治疗中将发挥更大作用，有望成为新型的临床治疗手段。