金属有机框架与大肠杆菌杂合体光驱产氢研究

李佳璐,沈俊峰,曾翠平,侯燕萍,王 博

(1.广西大学资源环境与材料学院,广西 南宁 530004;2.中国科学院深圳先进技术研究院,广东 深圳 518005)

0 引言

工业文明的快速发展使得人类生活水平不断提高,然而不断加速的化石燃料开采与消耗导致能源危机日趋严重,环境日益恶化[1]。因此,必须采取有效措施加大对太阳能等清洁能源的转化利用。开发光能驱动的能源与化学品生产途径有助于解决环境和能源问题,促进人类社会的可持续发展[2]。二十一世纪以来,氢气作为环境友好型能源的代表受到了人们的广泛关注。目前主流的制氢工艺为化石能源重整制氢,该工艺技术成熟,成本也相对低廉,但是其制氢原料主要以石油、天然气等化石资源为主,生产过程会排放大量的温室气体并污染环境[3]。生物体可通过代谢过程将水、有机废物或生物质转化为氢气,该过程绿色无污染。由于生物体自我复制的特性,生物催化剂的成本相对较低,且制氢过程可以在常温常压下进行,因此具有巨大的开发潜力和产业前景[4]。然而,目前生物制氢工艺尚未完全成熟,其工业化受产氢效率低下的制约,仍需进行深入研究。半导体材料光催化分解水制氢是太阳能转化利用的最理想方式之一,近年来该技术得到了越来越多研究人员的关注[5,6]。这种方法理论上简单高效,且光催化剂具有光收集效率强和吸光范围大等优点。然而,很多光催化剂存在制备过程繁杂、带隙过宽,在制氢过程中催化剂易发生光腐蚀等缺点。因此,当前基于生物制氢及材料光解水制氢的两个领域都存在明显的自身发展限制。

近年来,人们开始把目光转向将二者优点相结合的材料-生物杂合系统。该系统由高效光敏剂和高选择性催化中心组成,光敏剂通常为无机半导体、有机半导体、光敏染料、量子点等材料,而催化中心则使用纯酶或细菌细胞[7,8]。此类杂合系统不仅可以实现非常高的产品选择性,而且光敏材料的选择也足够丰富,从而可以使流向催化中心的电荷流最大化,生物体自我修复特性也赋予了杂合系统更高的稳定性。同时,部分微生物易于进行代谢工程改造从而生成更高价值的产品,扩展性强,有较好的研究和应用前景[9]。2016年杨等人通过将培养液中的镉离子和半胱氨酸通过生物转化途径合成了硫化镉(CdS)纳米粒子,并沉淀在产乙酸菌表面,从而诱导产乙酸菌产生自光敏作用,实现了光照下合成乙酸[10]。2017年王等人将CdS纳米颗粒沉淀在大肠杆菌(Escherichiacoli)表面,在一定的光强辐照下,杂合系统的表观量子效率最高可以达到9.59%,高于许多光合细菌[11]。在2018年姜等人在大肠杆菌表面形成了硫化银(AglnS2)/硫化铟(In2S3)的固态异质结,构建了AglnS2/ In2S3@E.coli杂合系统收集光能从而生产氢气[12]。同年,赵等人在大肠杆菌上利用表面展示技术优化了硫化镉纳米粒子的合成方法,光驱产氢效果得以进一步提升[13]。人们也设计了相比于纳米材料尺寸更小的量子点材料用于构建杂合系统,例如2021年罗等人通过将硫铟铜(CuInS2)/硫化锌(ZnS)量子点递送到希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1细胞中,实现了光驱产氢[14]。2022年,氮化碳(C3N4)量子点材料也被用于与大肠杆菌构建杂合体进行光驱产氢研究[15]。除此之外,人工染料(如曙红Y)亦可作为光敏剂穿过膜并与大肠杆菌中细胞色素P450的血红素结构域结合,从而有效地提升电子转移效率[16]。

金属有机框架材料(metal-organic framework, MOF)作为新兴的功能材料,可通过金属离子和有机配体进行自组装而获得。它不仅具有类似沸石分子筛规则孔道的晶态结构,同时具有比传统多孔材料更高的比表面积,由于有机成分的存在又使其兼具可设计性、孔径大小可调性、孔道表面易功能化等优点[17]。MOF材料在气体吸附、电极材料制备、催化领域中都得到了广泛的应用[18]。2018年杨等人使用MOF包裹热醋酸分枝杆菌以保护细胞。MOF外壳对活性氧自由基(Reactive oxygen species)分解的催化活性使严格厌氧细菌在21%的氧气浓度下的死亡数量较之前减少了五倍,并使细菌能够在氧化应激条件下通过CO2固定连续生产乙酸盐[19]。然而,当前MOF作为捕光材料与细菌进行杂合的研究鲜有报道,故MOF材料在材料-微生物杂合系统的应用有待进一步探索。前期光驱产氢研究中,大肠杆菌已体现出拓展性强、易培养和易改造等优点,但也存在电子传递效率不高,电子传递机理不清等问题[20]。近年来基于锆氧簇构建的MOF材料被广泛应用于光催化研究领域[21,22],在本文中,我们将基于内消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)及氯化锆(ZrCl4)合成金属有机框架PCN-222,并构建MOF材料与大肠杆菌的杂合体,研究MOF材料的光电响应性质以及大肠杆菌在光照下的产氢性能。进一步通过研究细胞内能量变化分析能量传递机理,为未来进一步优化该杂合体平台提供重要参考。

1 实验部分

1.1 实验材料、菌株以及培养基

无水氯化锆(ZrCl4)、苯甲酸(C6H5COOH)、N,N二乙基甲酰胺(DEF)、内消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Ag /AgCl 参比电极、Pt 对电极,上海越磁电子科技有限公司;NAD+/NADH检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司。实验中使用的大肠杆菌E.coli为野生型MG1655菌株,培养过程中分别使用LB培养基、BC培养基(磷酸氢二铵10 g/L、硫酸钾2 g/L、氯化钠0.3 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、七水硫酸亚铁4 mg/L、七水硫酸锌0.9 mg/L、无水硫酸铜0.4 mg/L、无水硫酸锰0.2 mg/L、二水氯化钙0.8 mg/L、十水硼砂0.09 mg/L、五水亚硒酸钠0.6 mg/L、七钼酸铵0.4 mg/L、硫酸镍铵0.9 mg/L,pH调整至7)、SBC培养基(磷酸氢二铵10 g/L、硫酸钾2 g/L、氯化钠0.3 g/L)。

1.2 PCN-222的合成和形貌与成分表征

将ZrCl4(0.12 g, 0.515 mmol)和C6H5COOH(4.05 g, 33.16 mmol)溶解在 24 mL DEF中并超声处理1 h.将混合物在烘箱中于 90 ℃加热 2 h.向加热的溶液中加入TCPP(0.06 g, 0.075 mmol),超声溶解20 min,将混合物放置于反应釜内在120 ℃烘箱中加热反应48 h.冷却至室温后,过滤得到紫色板状晶体。使用扫描电子显微镜(蔡司EVO 18型,德国)表征PCN-222的微观形貌。使用X射线衍射仪(XRD,理学Rigaku D/MAX 2500V,日本)分析材料结构。使用傅立叶红外光谱(FTIR,Thermo Scientific iN10,美国)进行材料测试。使用X射线光电子能谱仪(XPS,Thermo Scientific Nexsa,美国)分析PCN-222的元素组成。使用紫外可见分光光度计(UV-Vis,岛津Shimadzu UV-3600,日本)测定PCN-222在200～800nm范围内的吸光度。

1.3 PCN-222的电化学性能表征

制备工作电极:裁剪边长为2×1厘米的长方形碳纸,取5 mg材料融于990 μL异丙醇及10 μL Nafion溶液中,超声后将液体均匀的涂抹在碳纸的两面,晾干后用电极夹夹紧。将工作电极、参比电极(Ag/AgCl参比电极),对电极(Pt丝电极)安装在电解槽中(石英,体积50 mL),加入30 mL 0.5 mol/L的Na2SO4电解质溶液。光照条件为LED白光,光照强度为38.93 W/m2.在电化学工作站(CHI660E,上海华辰,中国)上分别进行光电流测试(i-t)以及交流阻抗(EIS)测试。

1.4 PCN-222@E.coli杂合体系的构建与表征

用枪头或接种环挑取野生型Mg1655E.coli的单菌落放入50 mL离心管,其中放入5 mL LB培养基。放入37 ℃摇床,过夜。将活化后的E.coli加入新鲜LB,将OD调为0.1在37 ℃摇床进行扩培,经过七个小时取出。将E.coli离心,使用PBS离心清洗两次。把菌放入BC培养基,并在体系中加入30 mM葡萄糖。把材料按经实验优化后的比例(3 mg/20 mL)加入培养基内。将装有菌和PCN-222的250 mL三角瓶放入厌氧罐内,同时迅速将厌氧袋放入其中。将厌氧罐放入37 ℃培养箱中的搅拌器之上(转速为250 rpm),过夜。使用台式场发射扫描电镜(Pharos,Phenom,中国)对杂合体系的表面形貌进行拍摄,并对样品中的Zr、C、N、O元素进行能谱(15 kV)扫描。使用Zetasizer pro(Blue/Red)电位仪(英国Malvern公司)对杂合体系的表面电位进行分析。

1.5 产氢检测与细胞内还原力水平检测

将E.coli从LB中离心,再使用灭菌PBS离心清洗两次。把菌放入SBC培养基(含20 mM葡萄糖)。将培养基分装成每份20 mL后放入50 mL光反应瓶,充入氮气并使用热熔胶将其密封。将密封好的光反应瓶放入多通道(自动控温)光催化反应系统(PCX50C Discover,泊菲莱,中国)开始反应,将光强调至20%,温度调整至37 ℃.反应一共进行四小时,每个小时进行一次取样。用微量进样针(100 μL)抽取顶空体积100 μL手动打进气相色谱仪(GC9790Ⅱ,福立,中国)进样口,进行氢气含量测量,方法为外标法,载气为氩气(纯度> 99.99%),流量为30 mL/min,检测器为热导检测器(TCD检测器),柱温箱温度为80 ℃,出峰位置在5 min左右。分别用NAD+/NADH检测试剂盒检测细胞内NADH/NAD+.使用96孔板(Tecan Safire Abs,瑞士)测定吸光度,并使用标准曲线计算单个化合物的浓度。

2 结果与讨论

2.1 PCN-222的合成与表征

从扫描电子显微镜(SEM)显示的形态和微观结构可以观察到,本研究中所合成材料呈现出长度不一的中空棒状形态和较为粗糙的表面。X射线衍射(XRD)图像(图1b)显示,该样品主要特征衍射峰出现在2°～10°之间。所获得的XRD图案与先前文献中所报道的PCN-222一致[21],表明成功合成了PCN-222.傅里叶变换红外(FTIR)光谱(图1c)显示,在3 400 cm-1出现的宽峰归因于羟基的拉伸振动峰,表明样品中存在结合水或者游离水。在1 000 cm-1处存在-COOH的振动峰表明在制备的PCN-222结构中存在TCPP化合物。1 800～1 400 cm-1处出现的的振动峰可归因于PCN-222中C=0与N-H的对称振动和不对称振动峰,与先前报道的文献一致[23]。使用X射线光电子能谱(XPS)研究了PCN-222的化学组成。从0到1 300.0 eV的XPS光谱描绘了Zr 3d、C 1s、N 1s、O 1s的特征结合能特征(图1d)。综上所述,本研究成功基于内消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)及氯化锆(ZrCl4)合成了金属有机框架PCN-222材料,并将基于此材料进一步构建与大肠杆菌E.coli的杂合体以展开探索。

图1 a)扫描电子显微镜图;b)X射线衍射谱图;c)傅里叶变换红外光谱图;d)X射线光电子能谱图

2.2 PCN-222@E.coli杂合体的构建与表征

为了验证PCN-222与大肠杆菌E.coli的杂合情况,采用扫描电子显微镜、能量色散X射线光谱(EDS)图谱研究了PCN-222@E.coli杂合体系。从图2a的SEM图像可以清晰看出,PCN-222的表面以及周围都散落着大肠杆菌,且有大量大肠杆菌团聚在PCN-222表面。图1b的Zr元素的EDS图谱分析证实了SEM图中的高亮棒状物体为PCN-222,因为Zr元素为PCN-222的独有元素。而图2c～e为C、N、O元素,这是PCN-222与大肠杆菌二者都具备的元素,这三张图显示PCN-222与大肠杆菌之间形成了较为紧密的接触。通过Zeta电位仪测得PCN-222的表面电位为21.7 mV,大肠杆菌表面电位为-69.58 mV,杂合体的表面电位为-51.36 mV(图2f)。由此可见,PCN-222与E.coli二者表面存在正负电荷相互吸引力,促进了PCN-222@E.coli杂合体系的形成,也是大肠杆菌团聚在PCN-222表面的主要成因。

图2 a)PCN-222-@E.col杂合体在2 μm比例下的 SEM 图像;b、c、d、e)Zr,C,N,O四种元素的X射线能谱面扫分析;f)PCN-222、E.coli、PCN-222-@E.coli杂合体的zeta电位图

2.3 PCN-222的光电活性研究

材料的光电化学活性是决定材料-生物杂合系统光能转化效率的决定性因素。为了进一步了解PCN-222的光电特性,使用紫外可见漫反射(UV-Vis)并通过光电流测试(i-t)、电化学阻抗测试(EIS)等多种测试技术对PCN-222进行测试。UV-Vis一般可用于催材料表面的光吸收性能的测定,PCN-222的紫外可见漫反射光谱如图3a所示。PCN-222在200～800 nm范围内具有相对较强的吸收,表明可以在可见光下进行电子跃迁。氮化碳(C3N4)是一种典型的聚合物半导体,其带隙符合光解水制氢的热力学要求,并且也被广泛应用于半人工及人工光合领域[24]。图3b和图3c为在三电极体系下,将所制备的PCN-222或C3N4涂覆于碳纸表面作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极、铂丝作为对电极,进行了i-t以及EIS测试后得到的图像。如图3b所示,PCN-222在重复的光开/关循环中保持着快速、稳定、重复性强的光电流响应,并且与C3N4相比,PCN-222具有更高的光电流,这表明PCN-222具备更优越的光响应和更高的电子迁移效率。除了i-t外,本文还利用EIS技术表征了PCN-222的性能。从图3c可知,无论在光照或者黑暗条件下,从PCN-222获得的电化学阻抗Nyquist谱图均显著低于C3N4,说明使用PCN-222与E.coli组成杂合系统,有利于形成材料与细菌表面快速的界面电荷转移。为了进一步验证PCN-222捕获的光能是否被传递到大肠杆菌中,我们使用光致发光光谱(PL)研究了PCN-222@E.coli杂合体在非生物和生物界面上的电子转移。如图3d所示,在单独的大肠杆菌细胞中没有观察到荧光信号,而与单独使用PCN-222相比,PCN-222与大肠杆菌杂合后导致荧光信号强度有所下降。这表明大肠杆菌作为电子受体,从PCN-222端获取了光电子,并有效抑制了电子与光生空穴的复合速率。由此可见,本研究中所合成的PCN-222材料具有广谱的捕光性能和优异光电化学活性,且在与E.coli组成的杂合系统中,可以有效地将光生电子传递给活细胞,为杂合体高效转化利用光能进行氢气合成奠定了重要基础。

图3 a)PCN-222的紫外-可见光光谱图;b)PCN-222与C3N4的光电流测试;c)PCN-222与C3N4化学阻抗测试图谱;d)PCN-222、E.coli、PCN-222@E.coli杂合体的光致发光图谱

2.4 杂合体光驱产氢性能和胞内能量分析

为了验证杂合体系的光驱产氢性能,通过设置黑暗或光照条件(使用光照强度为38.93 W/m2的发光二极管照射)、间隔一小时取样的方式检测了其在反应四个小时内的氢气产量。在相同的条件下,纯PCN-222在黑暗或光照下均未检测到H2产生。如图4a所示,黑暗及光照组的产氢量在4 h内都呈上升趋势。在黑暗条件下,纯菌组的4 h氢气产量为591.75 μmol/L,杂合体略高于纯菌组(1 040.31 μmol/L)。在光照条件下,纯菌组4 h的氢气产量为1 330.47 μmol/L,而杂合体在光照下的4 h氢气产量达到了3 865.7 μmol/L,达到了黑暗下纯菌组的6.5倍。据报道,光电子可以通过膜结合蛋白的直接电子转移或通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)间接介导。且NAD+可以作为光电子受体转化为NADH,为厌氧发酵等氧化还原反应提供关键的还原动力,当还原力过剩时,将以H2的形式释放[25]。因此,我们进一步检测了不同条件下细菌体内的NADH与NAD+的比值(NADH/NAD+)。从图4b中可见,杂合体在光照的4小时内胞内还原力显著提升,而其他对照组则变化不明显。该结果与图4a中杂合体的氢气产量结果相吻合。因此,实验结果证明来自PCN-222的光电子将NAD+还原为NADH,从而提升大肠杆菌的氢气产量。结合光电子转导的结果及其在生物产氢中的作用,根据上述结果,我们提出了PCN-222@E.coli杂合体产氢的机理机制,如图4c所示。由于静电相互作用,表面带正电的PCN-222与带负电的E.coli自组装成PCN-222@E.coli杂合体系。在适度的光照下PCN-222会产生大量的电子-空穴对,其表面的光生电子可以通过细胞膜传输到E.coli体内,而E.coli额外获得的这些光生电子提高了胞内的还原力水平(即NADH/NAD+),导致过量的还原力以氢气的形式释放,因此氢气的产量得以提升。

图4 a)PCN-222@E.coli杂合体与大肠杆菌在光照和黑暗条件下四个小时内的氢气产量;b)PCN-222@E.coli杂合体与纯大肠杆菌在黑暗和光照下培养0、1、2、3、4h的NADPH/NADP+;c)杂合体的产氢机理示意图

3 结论

在本研究中,我们合成了PCN-222并通过一系列的技术手段对其基本性能进行表征,随后通过PCN-222与大肠杆菌的静电吸附结合构建了PCN-222@E.coli杂合体。通过研究杂合体系的产氢能力来检验PCN-222对大肠杆菌能量传递的效果,从而验证金属有机框架-大肠杆菌杂合体在光驱产氢路径开发方面的可拓展性。最后进行了胞内能量传递机理研究,为未来进一步优化该杂合体平台提供重要参考。