新疆外来入侵杂草豚草属LAMP快速检测技术的建立

于海鑫, 付开赟, 丁新华, 贾尊尊, 吐尔逊·阿合买提, 王 兰*, 郭文超*

1塔里木大学农学院,新疆 阿拉尔 843300; 2新疆农业科学院植物保护研究所/农业农村部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830091

豚草属AmbrosiaL.系菊科向日葵族,起源于美国西南部和墨西哥北部的索诺兰沙漠地区(曾珂等,2010),共有41个种,其中入侵至中国的菊科豚草属植物为三裂叶豚草AmbrosiatrifidaL.和豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.,这2种杂草是入侵性恶性杂草,也是世界上公认的有害植物,素有“植物杀手”之称(万方浩等,2005)。20世纪50年代传入我国(李素德等,1990),随后沿交通线四处蔓延,目前在黑龙江、辽宁、北京等多地均有发现(梁巧玲和路平,2014)。2010年,在新疆伊犁河谷首次发现豚草和三裂叶豚草,至2013年,两者其在当地的分布面积分别达到10和15 hm2(董合干和宋占丽,2017)。

三裂叶豚草和豚草因繁殖力强、扩散速度快、竞争力强,在生长过程中极易排斥其他植物,形成优势群落,给新疆农牧业的健康发展造成严重危害。它们入侵草原,引起草原退化,造成草地服务能力下降(梁巧玲和路平,2014);花粉对人类健康也有危害(王蕊等,2012; 谢俊芳等,2011),严重者可致人过敏甚至死亡(马丽娟等,2020)。三裂叶豚草形态多变,除正常的3～5掌状深裂叶类型外,还有叶不裂型、深齿型和全裂叶型3种变型,从而造成识别困难(关广清,1990)。豚草在开花前常与大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd. 、野艾蒿ArtemisialavandulifoliaDC.、小花鬼针草BidensparvifloraWilld.等相混淆(关广清,1985)。三裂叶豚草和豚草在种子期、幼苗期形态特征极为相似,难以辨识,故建立快速检测技术对三裂叶豚草和豚草的准确识别至关重要。

Notomietal. (2000)研发了一种新型的核酸扩增方法-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,该技术针对目的片段设计4条引物(1对外引物:F3和B3,1对内引物:FIP和BIP) ,在链置换DNA聚合酶作用下,将目的片段在等温条件下进行扩增,其产物是众多大小不一的DNA片段的混合物。Nagamineetal.(2002)开发出额外的一对引物,称之为环引物(LF和LB),能够提高LAMP反应的效率。与常规的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测相比,该技术具有操作简便、特异性高、灵敏度高、结果易于观察判断等优势,也因此备受关注(董文敏等,2020)。在植物病原物与入侵害虫检测中,已有很多应用该技术的报道,如麦根腐平脐蠕孢BipolarissorokinianaShoem(崔林开等,2022)、苹果轮纹病菌Botryosphaeriadothidea(Moug)(汪少丽等,2020)、油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa(杜然,2019)、茶黄硬蓟马ScirtothripsdorsalisHood (黄丽莉等,2021)、瓜实蝇BactroceracucurbitaeCoquillett(钟勇等,2019)、根结线虫Meloidogynespp.(吴文涛等,2019)等,但目前有关该技术在植物检测上的研究报道还较少。

鉴于此,本研究拟利用三裂叶豚草和豚草特异性序列设计一套LAMP引物,并对反应条件和反应体系进行优化,以建立三裂叶豚草和豚草的快速检测技术,以期实现田间快速精准识别三裂叶豚草和豚草并阻止其扩散。

1 材料与方法

1.1 供试材料

主要实验材料:三裂叶豚草采自新疆维吾尔自治区哈萨克自治州新源县铁热克阿吾孜村(83°37′50.40″E,43°52′15.40″N,海拔817.9 m),豚草采自新疆维吾尔自治区哈萨克自治州新源县109乡道(83°21′77.91″E,43°43′67.70″N,海拔 874.7 m)。对照材料艾草ArtemisiaargyiH.采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市新疆农业科学院综合试验场(87°48′31.73″E, 43°95′78.83″N,海拔 874.7 m)。

主要实验试剂:DNA裂解液购自宝日医生物技术(北京)有限公司,Bst II DNA polymerase 8 U·μL-1Glycerol-free、10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4)、dNTP Mix(10 mmol·L-1each)和核酸染料 SYBR Green I均购自上海翊圣生物科技有限公司等。

1.2 基因组 DNA 的提取

使用TaKaRa的DNAiso Reagent提取试剂,实验步骤参考试剂说明(https:∥www.takarabiomed.com.cn/)。

1.3 LAMP引物设计与合成

在Bold Systems v4网站(http:∥www.boldsystems.org/index.php/Public_SearchTerms)上获得三裂叶豚草和豚草的基因序列。其中,三裂叶豚草GenBank:rbcLa:491;豚草GenBank:MH517698。选用NEBLAMP (https:∥lamp.neb.com/#!/)在线设计引物,设计3套引物同时选取其中1套进行引物合成,引物信息见表1。序列在金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

表1 用于LAMP检测的引物信息

1.4 LAMP反应体系

LAMP反应体系:2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (10 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL,4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后加入灭菌超纯水至25 μL。上述试剂混均匀后,放置于恒温55～65 ℃水浴锅中反应60 min,80 ℃灭活5 min,筛选出最佳反应时间。

1.5 LAMP特异性检测

针对三裂叶豚草和豚草的不同发育阶段(幼苗期、生长期、种子期),通过提取基因组DNA,进行扩增反应。使用焦磷酸酶沉淀-比浊法,开展LAMP检测技术的开发。以清水和艾草为对照,如产生沉淀则为阳性,如未产生沉淀则为阴性(林瑶等,2014)。

1.6 LAMP灵敏度检测

选用特异性检测结果最稳定的叶片作为灵敏度检测对象。提取浓度为127.5 ng·μL-1,然后用无菌水进行10倍梯度稀释,使其终浓度分别为100、10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11ng·μL-1,最终使用不同浓度作为模板进行LAMP反应,以ddH2O为空白对照。反应结束后加入1 μL核酸染料SYBR Green I,若其结果为阳性,则为明显的绿色荧光,而阴性结果则为橙色,并以此检测LAMP技术的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应体系的建立

LAMP引物最佳反应温度为65 ℃。用于检测三裂叶豚草和豚草的LAMP最佳反应体系: 2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (16 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL, 4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后灭菌超纯水补足25 μL。反应程序:在65 ℃恒温水浴锅中温育1 h,80 ℃变性5 min,使Bst DNA 聚合酶失活。最后加入核酸染料SYBR Green I,结果出现明显的绿色荧光为阳性,出现橙色则为阴性。

2.2 三裂叶豚草和豚草LAMP特异性检测

使用本研究设计的三裂叶豚草LAMP引物Atr-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以豚草和艾草对照,对三裂叶豚草幼苗期、生长期、种子期进行LAMP扩增,结果(图1)显示,只有三裂叶豚草产生白色沉淀,有阳性反应,豚草和艾草对照均无产生白色沉淀,为阴性反应。

图1 三裂叶豚草LAMP特异性检测

使用本研究设计的豚草LAMP引物Aar-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以三裂叶豚草和艾草为对照,对豚草幼苗期、生长期、种子期进行LAMP扩增,结果(图2)显示,只有豚草产生白色沉淀,有阳性反应,三裂叶豚草、艾草对照均无产生白色沉淀,为阴性反应。以上结果说明,该LAMP引物具有较强的特异性。

图2 豚草LAMP特异性检测

2.3 三裂叶豚草LAMP灵敏度检测

因三裂叶豚草和豚草基因组DNA提取方法与灵敏度检测方法一样,故本研究只进行三裂叶豚草实验验证。提取三裂叶豚草基因组DNA,紫外分光光度计测量提取的基因组DNA浓度为127.5 ng·μL-1,将DNA浓度调整为100 ng·μL-1,进行10倍梯度稀释为模板进行LAMP扩增,验证LAMP体系的灵敏度。从LAMP反应结果(图3) 可以看出,DNA浓度为10-10ng·μL-1以下的实验组反应液呈浅橘色,DNA浓度为10-10ng·μL-1及以上的实验组反应液颜色为荧光绿,表明LAMP引物最低限度为10-10ng·μL-1。

图3 三裂叶豚草LAMP灵敏度检测

3 讨论与结论

LAMP检测方法具有操作快速简便、特异性强、灵敏度高、检测成本低等优点,该技术已广泛运用于植保等领域。国外学者最初通过LAMP检测番茄花叶病毒病(Shiroetal.,2003);彭军等(2013)建立的柑桔黄龙病LAMP技术可以检测到最低下限约为1 pg·μL-1质粒DNA,是PCR检测灵敏度的100倍;王贤达等(2014)利用LAMP技术检测柑橘黄龙病病原菌,检测灵敏度达10-6ng·μL-1,是普通PCR的1000倍,为柑橘黄龙病早期诊断提供了快速检测的方法;钟勇等(2019)建立的瓜实蝇快速可视化分子检测方法可检测到1.65 ng·μL-1的DNA模板,能够将瓜实蝇与其近似种进行区分。

本研究通过三裂叶豚草和豚草的DNA序列区间设计了3组引物,并从中筛选获得1组引物,通过优化反应体系的温度以及时间,建立了高效检测三裂叶豚草和豚草的LAMP技术体系。通过对前期优化后的反应体系与反应条件进行验证,该LAMP体系仅对三裂叶豚草和豚草的特异性检测结果呈阳性,且灵敏度结果中最低检测限为10-10ng·μL-1,优于常规PCR的检测结果;此外,LAMP快速检测技术在反应时间方面具有较大优势,常规PCR对目标DNA片段的检测需要花费2～4 h,LAMP体系反应时间仅需1 h,且设备成本较低。但是本实验所使用的商品裂解液与SYBR GreenⅠ荧光染料成本较高,对引物设计的要求比较高且LAMP产物不能进行后续实验(秦文韬等,2013)。

尽管LAMP技术还存在一些缺点和不足,但随着LAMP技术的日益完善和发展,加上LAMP所需仪器设备价格极低、扩增快速高效、适合各种环境下的快速检测、实用性强等优点,LAMP有望成为检测入侵性杂草的常用工具,并将在入侵性杂草的分子检测和诊断中发挥更大的作用。后续应开展三裂叶豚草和豚草DNA快速提取方法的建立与优化研究,并与本研究的LAMP检测体系相结合,提高其检测能力,从而实现检测体系的高效、便捷,以达到从入侵种子源头控制的目的,这不仅可以为识别鉴定外来入侵性杂草三裂叶豚草和豚草提供技术支撑,还能为三裂叶豚草和豚草的绿色防控提供参考(胡章薇等 2021; 朱志伟和赵金红,2020)。