黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病的防治效果及其增菌条件

黄晨颖, 张艳芬, 吴守欣, 赵莉蔺, 石 娟*

1北京林业大学,中法欧亚森林入侵生物联合实验室,北京 100083; 2中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京 100101; 3中国科学院大学,中国科学院生物互作卓越创新中心,北京 100049; 4河南省卢氏县森林病虫害防治检疫站,河南 三门峡 472200

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(Steiner &Buhrer)是一种林业重大入侵生物,可引起被称为松树“癌症”的松树萎蔫病,造成重大的生态环境危害和经济损失(赵添羽等,2022; Mamiya,1983)。自1982年入侵我国以来,松材线虫在传播媒介松墨天牛MonochamusalternatusHope的协助下,已扩散至19个省(区、市)、732个县级行政区(国家林业和草原局2022年第6号公告),累计致死松树超过6亿株(宁静等,2018; 张志国,2020)。目前,在对松树萎蔫病的所有防治措施中,生物防治是对环境最友好的方法(李恩杰等,2019)。

黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens广泛分布于自然界,是水和土壤中的长居菌群。近年来研究发现,黏质沙雷氏菌在生防领域具有良好的应用潜力。傅仁杰等(2019)、Fuetal.(2021)从被感染的黑翅土白蚁Odontoternesformosanus(Shiraki)上筛选到的黏质沙雷氏菌SM1可以使健康的白蚁身体变红死亡;涂爽等(2009)从中华蜜蜂ApisceranaFabricius肠道中分离到的黏质沙雷氏菌GEI通过产生的几丁质酶能防治蜜蜂病害狄斯瓦螨VarroadestructorAnderson &Trueman;傅慧静等(2020)研究发现,分离自松墨天牛肠道的黏质沙雷氏菌HX-3可通过产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶实现其对木质素的降解功能,从而降低蛀干害虫的营养摄入。此外,还有不同黏质沙雷氏菌株防治亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri( Kuwayama)若虫(邝凡,2019; Huetal.,2021)、黄胫小车蝗OedaleusinfernalisSaussure (冯书亮等,2002)、褐飞虱Nilaparvatalugens(Stal)、二化螟Chilosuppressalis(Walker)(王渭霞等,2014)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hubner)(杨建云等,2015; 赵晓峰,2017)等的报道。不同种类的黏质沙雷氏菌还对不同的植物病原细菌(Pressetal.,1997)、真菌(Purkayasthaetal.,2018; Wangetal.,2013)和病毒(Geetal.,2021)有抗菌活性。

本研究团队从松墨天牛的蛹室及其气管中筛选到一株黏质沙雷氏菌AHPC29,发现该菌对松材线虫及其传播媒介松墨天牛具有致死作用(Tianetal.,2022),但其对松树萎蔫病的作用效果尚不清楚。为确定黏质沙雷氏菌AHPC29作为松树萎蔫病生防菌剂的可行性,本研究测试了黏质沙雷氏菌AHPC29对人工感染松材线虫松树萎蔫病的防治效果,并研究了培养基组分和培养条件对其生长的影响,以期为该菌株作为生防菌剂进行生产应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

材料:菌株SerratiamarcescensAHPC29分离自安徽天牛蛹室(Tianetal.,2022)。松材线虫虫株从中国陕西省柞水县发现的松材线虫病枯死松树中分离得到(Mengetal.,2020),在实验室内用灰葡萄孢菌饲养。

试剂:LB培养基(酵母粉5 g·L-1、胰蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1)、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖、蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、复合氨基酸、KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4。

仪器:LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安)、YP5002电子天平(上海越平)、OptiMair超净工作台(新加坡ESCO)、HZQ-F100全温振荡培养箱(上海培英)、SpectraMaxi3酶标仪(美国Molecular Devices)。

1.2 方法

1.2.1 黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病作用效果 选取生长状态相近的2年生黑松PinusthunbergiiParlatore幼苗15株,以人工接皮法向每株黑松接种2000条线虫,在28 ℃、180 r·min-1条件下在LB培养基上培养48 h后,将AHPC29原菌液根灌溉至5株接种过松材线虫的黑松幼苗根部,每棵20 mL,无菌水处理的5株作为对照组,于温室32 ℃继续培养。每周根灌一次,45 d后,对照组黑松全部死亡,采集所有松树样品带回实验室,采用贝尔曼漏斗法对线虫进行分离,使用倒置显微镜对线虫进行计数,统计最终每株树苗中的线虫量。

1.2.2 培养基单组分筛选及其组合优化 以LB培养基为基础,分别选用葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖作为碳源,蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、复合氨基酸作为有机氮源,KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl作为无机氮源,K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4作为无机盐,对培养基组分进行优化。碳源、氮源和无机盐质量百分比浓度均参考LB培养基配方,分别为0.5%、1%和1%。进行各组分优化时,其余组分在28 ℃、180 r·min-1条件下在LB培养基上培养48 h,结束后用分光光度法测定光密度D600 nm,每处理3个重复。

基于培养基组分的单因素实验结果筛选出的最优碳源、有机氮源、无机氮源和无机盐组分,通过正交实验确定各组分浓度,正交实验方案采用L9(34)正交表。实验条件为28 ℃、180 r·min-1,培养48 h后用分光光度法测定光密度D600 nm,每处理3个重复。

1.2.3 培养条件的影响 在以上已优化的培养基的基础上,继续设置单因素实验对以下因素进行筛选:接种量(1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%)、装液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、摇床转速(0、60、120、180、240 r·min-1)、培养温度(25、28、30、35、37 ℃)、培养时长(12、24、36、48、60、72 h)。原始增菌的培养条件为接种量5%、装液量30%、摇床转速150 r·min-1、温度28 ℃、时长24 h,以每一培养条件优化后的结果为基础进行下一步培养条件的优化。

1.3 数据分析

统计分析使用IBM SPSS Statistics 21软件,结果绘图采用OriginPro 2017软件。黏质沙雷氏菌AHPC29防治松材线虫实验结果统计分析采用独立样本T检验,培养基单组分筛选实验结果和增菌条件优化实验结果采用单因素方差分析。

2 结果和分析

2.1 黏质沙雷氏菌AHPC29对松材线虫的作用效果

黏质沙雷氏菌AHPC29对感染松材线虫松树的作用效果如图1所示。待对照组松树全部死亡后,菌液处理组的松树生长状态依然良好,接种菌液组松树的松材线虫的数量与对照组相比降低88.5% (P=0.0016<0.01),说明黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病的防治具有良好效果。

图1 黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病的作用效果

2.2 培养基组分对黏质沙雷氏菌AHPC29生长的影响

不同碳源条件下的黏质沙雷氏菌AHPC29的生长情况(图2A)表明,黏质沙雷氏菌AHPC29在以乳糖为碳源时有最高D600 nm值,与以牛肉膏为碳源时的生长情况相近,且2种碳源条件下的生长效果均显著优于其他碳源。以葡萄糖和蔗糖为碳源时,生长情况相对较差,说明黏质沙雷氏菌AHPC29对葡萄糖和蔗糖的利用率低于乳糖和牛肉膏。当以可溶性淀粉为碳源时,利用率最低。

图2 不同培养基组分对黏质沙雷氏菌AHPC29生长的影响

不同有机氮源的测试分析结果表明,以复合氨基酸为有机氮源时,D600 nm值最高,且显著高于以蛋白胨、尿素、豆粉和谷氨酸为氮源的生长情况(图2B)。以谷氨酸为有机氮源时,D600值最低。蛋白胨、尿素、豆粉作为氮源时,生长情况之间无显著差异。

不同无机氮源的测试分析结果(图2C)表明,以硝酸钾作为无机氮源时,黏质沙雷氏菌AHPC29有最高的D600 nm值,但是与以硝酸钙作为无机氮源之间无显著差异。以氯化铵为无机氮源时,生长状况最差,其D600 nm值显著低于以硝酸钾、硝酸钙为无机氮源的结果。

不同无机盐的测试分析结果表明,以硫酸镁作为无机盐时,黏质沙雷氏菌AHPC29有最高D600 nm值,但是与以磷酸二氢钾、硫酸亚铁作为无机盐之间无显著差异。以磷酸氢二钾为无机盐时,生长情况最差,其D600 nm值显著低于以磷酸二氢钾、硫酸亚铁和硫酸镁作为无机盐时的结果(图2D)。

综合以上结果,增菌培养基的碳源、有机氮源、无机氮源和无机盐组分最佳选择分别为乳糖、复合氨基酸、硝酸钾和硫酸镁。

2.3 培养基组合优化

根据上述筛选出的最佳碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐,进行四因素正交实验,各因素均取3个水平,因素水平表见表1,正交实验方案及结果分析见表2。极差值的大小可以表明该因素水平的改变对结果的影响大小,根据各因素下极差值的大小可以看出,各因素对黏质沙雷氏菌D600 nm值影响的主次顺序为复合氨基酸>乳糖>MgSO4>KNO3。根据各因素下不同水平上实验结果的平均值(k)可以看出,乳糖的最优水平为水平1代表的0.1%浓度,复合氨基酸的最优水平为水平1代表的0.5%浓度,KNO3的最优水平为水平1代表的0.5%浓度,MgSO4的最优水平为水平3代表的1.5%浓度,即培养基的最优组合为0.1%乳糖、0.5%复合氨基酸、0.5% KNO3、1.5% MgSO4。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验方案及结果分析

2.4 培养条件对黏质沙雷氏菌AHPC29生长的影响

在最优培养基的基础上,分别测试增菌培养过程中接种量、装液量、培养转速、培养温度对黏质沙雷氏菌AHPC29生长的影响,其结果如图3所示。

图3 不同培养条件对沙雷氏菌AHPC29生长的影响

按1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的接种量分别接种后的增菌结果见图3A。结果表明,接种量在1%～7%时,黏质沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值呈上升趋势;接种量在7%～11%时,黏质沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值逐渐下降。尽管接种量为13%时D600 nm值有小范围回升,依然低于接种量为7%时的D600 nm值。因此,选择最佳接种量7%继续进行装液量、培养转速、培养温度和培养时间的优化。

装液量10%、20%、30%、40%、50%、60%的实验结果见图3B。由图可知,装液量为40%时沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值最高,且与其他装液量的结果差异显著,因此本实验选用40%为最佳装液量。

转速为0、60、120、180、240 r·min-1的实验结果如图3C所示,其中转速0 r·min-1下的增菌结果显著低于其他转速条件。尽管60 、120、180和240 r·min-1转速之间的结果无显著差异,但是转速在0～180 r·min-1时,D600 nm值呈上升趋势,转速为180 r·min-1时,D600 nm值达到最高点,因此选择180 r·min-1最为最佳转速。

培养温度是生长速率的关键影响因素之一,25、28、30、35、37 ℃条件下的增菌结果如图3D所示。结果表明,35和37 ℃的高温以及25 ℃条件均对黏质沙雷氏菌AHPC29的生长有显著抑制作用。30 ℃的增菌结果显著高于其他培养温度,最有利于沙雷氏菌AHPC29生长。因此本研究选择的最佳增菌温度为30 ℃。

随着培养时间的增长,黏质沙雷氏菌AHPC29的生长情况如图3E所示。结果表明,12～24 h生长缓慢,属于其生长调整期;在24～36 h内黏质沙雷氏菌AHPC29处于生长对数期;36～48 h时D600 nm值保持稳定,说明黏质沙雷氏菌AHPC29进入生长稳定期;培养60和72 h时,D600 nm值持续下降,说明黏质沙雷氏菌AHPC29进入衰亡期。

3 讨论

本研究通过温室实验证实了黏质沙雷氏菌AHPC29对已感染松材线虫的松树具有良好的效果,表明其具有良好的松树萎蔫病防治应用前景。

根据培养基各组分对黏质沙雷氏菌AHPC29生长影响的主次顺序可以看出,有机氮源对黏质沙雷氏菌生长的影响最大,说明有机氮源是黏质沙雷氏菌AHPC29生长的关键组分。在微生物的培养过程中,无机氮源主要用于微生物的早期生长,有机氮源主要用于微生物中后期的生长和物质积累,因此一般将有机氮源和无机氮源混合使用(杜丽红等,2019)。在测试的有机氮源中,复合氨基酸最有利于黏质沙雷氏菌AHPC29的生长,这应该与复合氨基酸直接含有的18种氨基酸成分可以直接用于微生物体内蛋白质合成以及脱氨转氨作用相关(杜丽红等,2019; 卢寅泉和刘照明,1995)。而谷氨酸作为有机氮源时的结果说明,仅有谷氨酸不能有效满足黏质沙雷氏菌AHPC29生长对氮源的需求。豆粉、蛋白胨与尿素对黏质沙雷氏菌AHPC29的生长情况无显著差异且均低于复合氨基酸,这与它们需要进一步水解或者分解之后才能利用的特点相一致。无机氮源的测试结果表明,黏质沙雷氏菌AHPC29对硝态氮的利用优于氨态氮。

对于黏质沙雷氏菌AHPC29,碳源是仅次于有机氮源的主要培养基组分。碳源是微生物生长的必需组分,为微生物提供细胞碳骨架以及生命活动所需的能量。在本研究中,作为双糖的乳糖最有利于黏质沙雷氏菌AHPC29的生长,而淀粉作为多糖最难被利用,说明黏质沙雷氏菌AHPC29在碳源中偏好乳糖,对淀粉的利用能力较弱。牛肉膏中含有有机碳、氮、维生素以及无机盐,尽管在大多数情况下它被作为氮源,但是本研究证实其可作为碳源显著促进黏质沙雷氏菌AHPC29的生长,这与一些研究中的结果也相一致(陈雅丽,2014; 倪海军,2016)。

在微生物的生长过程中,无机盐主要作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂以及调节培养基的渗透压、pH、氧化还原电位等。无机盐的测试结果表明,黏质沙雷氏菌AHPC29在无机盐KH2PO4、FeSO4、MgSO4之间的选择无显著偏好。K2HPO4和KH2PO4中的K+是磷酸丙酮酸转磷酸酶等的辅因子,并且可以维持电位差和渗透压,但两者在pH值缓冲方面的作用不一样,K2HPO4溶液为碱性,KH2PO4溶液为酸性。黏质沙雷氏菌AHPC29偏好使用KH2PO4,同时FeSO4、MgSO4也为酸性溶液,说明黏质沙雷氏菌AHPC29偏向利用酸性无机盐。

根据培养条件的测试结果可以看出,装液量、培养温度和时长是关键的影响因素,其最佳装液量为40%,最佳培养温度30 ℃,最佳培养时长36 h。25、35和37 ℃温度下的生长情况均显著低于28和30 ℃的结果说明,低温和高温均不利于黏质沙雷氏菌AHPC29的生长,这与郝林华等(2006)的研究结果一致。接种量结果之间无显著差异说明接种量对黏质沙雷氏菌AHPC29的生长影响不显著。黏质沙雷氏菌为兼性厌氧菌(Smithetal.,2009),可在有氧或缺氧条件下生长,无转速时的生长情况显著低于有转速的结果说明,有氧条件有利于黏质沙雷氏菌AHPC29的生长。