经鼻吸入复方精油提神醒脑的药效、作用机制及初步安全性研究

刘小金,刘日群,郑 琴,杨 明,胡鹏翼,李字棋,肖淑华

江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室,南昌 330004

现代社会,繁重的工作和生活压力致使人们白天犯困、易疲劳的现象越发严重,警觉度和认知功能下降是该症状的主要表现,短期服用兴奋剂类药物如咖啡因、莫达非尼等可缓解疲劳困倦,提高警觉性[1]。但长期摄入咖啡因会引起抑郁、易怒、心律失常、焦虑、失眠等不良症状;此外,咖啡因的利尿作用也可导致运动间脱水,体温调节能力下降[2]、心率加快和心脏负担[3];而莫达非尼会引起头痛、恶心和血压升高等不良反应,也有潜在的成瘾性与依赖性[4]。因此研究开发效果好、不良反应少的提神醒脑产品显得尤为迫切。

芳香疗法作为近年来兴起的一种补充替代疗法,是一种回归自然类似于整体治疗的方法。芳香疗法中所用的芳香物质或精油已有研究报道具有提神醒脑效果,如迷迭香精油、苏合香精油、薄荷精油、石菖蒲精油、冰片和柠檬精油等[5]。本文基于芳香疗法理论为指导,选择芳香开窍的薄荷醇、丁香精油、青柠檬精油等植物精油进行组方,经鼻吸入研究自制复方精油对小鼠自主活动及睡眠的影响,评价其提神醒脑的药效。采用酶联免疫法(ELISA)、Western blot技术检测兴奋性神经递质谷氨酸、多巴胺及其受体研究作用机制,并采用GC-MS分析复方精油化学成分,以期分析精油中可能产生兴奋作用的成分。另一方面,精油虽然具有较好的疗效,但有临床研究报道精油可能会引起不良反应[6],为确保临床用药安全,本文还研究自制复方精油经鼻吸入对小鼠进行初步安全性研究,以期为其安全使用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明小鼠(KM,SPF),雄性,体重为20±2 g,购买于江西中医药大学动物科技中心,动物生产许可证号:SYXK(赣)2022-0002,本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准,审批号:JZLLSC20210043。动物饲养于江西中医药大学动物科技中心屏障级实验室内,昼夜12 h交替,恒温(22±2)℃,相对湿度40%～70%,动物统一适应性喂养1周。

1.2 药品及试剂

复方精油,江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室提供,批号20220322,主要成分为薄荷醇、丁香精油、青柠檬精油等;咖啡因(批号PS11544,北京谱析科技有限公司);酒精消毒剂(南昌利康制药机械有限公司);PBS缓冲液(Solarbio);多巴胺酶联免疫吸附测定试剂盒(批号H170-1-2,Andygene);谷氨酸酶联免疫吸附测定试剂盒(批号H168-1-2,Andygene);多巴胺受体D1R抗体(批号ab279713,Abcam)。

1.3 方法

1.3.1 复方精油对小鼠提神醒脑的作用研究

1.3.1.1 实验动物分组和给药

40只昆明雄性小鼠,随机分成5组,每组8只。实验由对照组、咖啡因组和复方精油低(2×10-7mL/cm3)、中(5×10-7mL/cm3)、高剂量(8×10-7mL/cm3)组,为增加精油雾化效率,采用蒸馏水对复方精油进行适当稀释。对照组每天雾化吸入等量蒸馏水,阳性药组灌胃咖啡因57 mg/kg,前期预实验结果表明,复方精油雾化吸嗅给药15 min后能显著提高小鼠自主活动能力,本研究选择复方精油雾化吸入15 min,实验时间每日8∶00～16∶00,1次/d。精油给药剂量=雾化器复方精油加入体积(mL)/动物香薰室空间体积(cm3)。

1.3.1.2 复方精油对小鼠自主活动的影响

连续给药3 d,每天各给药组雾化吸入15 min,休息15 min后进行旷场实验。有研究表明,小鼠灌胃咖啡因后,在30～60 min 能达到最高血药浓度,小鼠灌胃咖啡因30 min 后活动能力显著增强[7],选择咖啡因组灌胃30 min后进行旷场实验。小鼠适应环境3 min,检测5 min内行为学参数:运动距离(cm)、平均速度(cm/s)、休息时间占比(%)。

1.3.1.3 戊巴比妥钠阈上睡眠诱导实验

另取30只昆明雄性小鼠,随机分成5组,每组6只。对照组和复方精油低、中、高剂量组小鼠均在实验第一天末次雾化吸入15 min,休息15 min,阳性药组灌胃咖啡因30 min后,均进行腹腔注射戊巴比妥钠阈上值55 mg/kg[8]。观察并记录各组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间,注射给药后,小鼠的翻正反射消失1 min,为入睡指标。从注射药物到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期,翻正反射消失至恢复的时间为睡眠持续时间,记录睡眠时间的潜伏期和睡眠时间。

1.3.2 复方精油对小鼠脑和血清GLU、DA含量的影响

吸嗅3 d,旷场实验结束后,各组小鼠摘眼球取血,后颈椎脱位处死,取出完整脑组织,PBS缓冲液清洗,滤纸吸干。血液室温静置1 h,3 500 r/min离心15 min,取上清液血清、脑组织暂存于-80 ℃。按照ELISA试剂盒说明书步骤操作检测小鼠脑组织和血清中谷氨酸(glutamic acid,GLU)和多巴胺(dopamine,DA)含量。

1.3.3 复方精油对小鼠脑内DA受体D1R的影响

另取一批昆明小鼠按“1.3.1.2”方法重复实验,吸嗅给药第3 d结束后,各组小鼠迅速颈椎脱位处死,取出全脑组织,用PBS缓冲液洗去血渍,在冰面上分离前额皮层、海马、下丘脑和其他脑组织,EP管分装存于-80 ℃用于Western blot分析。将冷冻组织(20 mg)在20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4、0.9% NaCl、0.5% Nonidet P40、1 mmol/L EDTA、129 mmol/L乙二醇四乙酸(EDTA)、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、1 000 KIU/mL 抑肽酶和10 μg/mL亮肽)中匀浆,并在冰上孵育15 min。在12 000 r/min和4 ℃下离心10 min后,使用BCA蛋白质测定试剂测量上清液的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上清液,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入一抗(D1R 1∶1 000),然后将膜与辣根过氧化物酶缀合的次级抗体(1∶2 000)孵育。转移的蛋白质用增强化学发光(ECL)底物溶液孵育,并用图像J程序(Bio-Rad,Richmond,CA,USA)可视化。通过使用Quantity One软件(BioRad Laboratories)对相对水平进行密度量化,并根据GAPDH的条参考带进行计算。

1.3.4 复方精油GC-MS的化学成分分析

气相色谱条件:采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛细管柱,载气为高纯度He(99.999%),进样量l μL,分流比50∶1,流速1 mL/min;程序升温:初始温度45 ℃(保持0 min),以3 ℃/min升温至70 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升温至90 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升温至140 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升温至180 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min升温至180 ℃,保持3 min;再以3 ℃/ min升温至220 ℃,保持5 min;再以5 ℃/min升温至280 ℃,保持5 min,进样口温度280 ℃,接口温度为250 ℃。

质谱条件:EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,MS四极杆温度150 ℃;界面温度250 ℃,溶剂延迟3.0 min,质谱扫描模式全扫描,扫描范围(m/z)30～650。标准谱库NIST11检索,采用峰面积归一化法计算各组分含量的相对百分比。

1.3.5 单次吸嗅复方精油对昆明小鼠安全性研究

因受试药物浓度、体积和雾化效率的限制,无法测定受试药物的半数致死量,提示其安全性较高,为进一步评价其安全性,进行最大给药量试验。预实验结果显示,当复方精油浓度达到2.07×10-4mL/cm3时,老鼠毛发湿润较严重,且该浓度下部分老鼠存在呼吸不适,可能是雾气浓度过高影响老鼠正常呼吸,即以复方精油浓度2.07×10-4mL/cm3为最大给药浓度剂量。

昆明小鼠雌雄各半,根据体重随机分成为雄鼠对照组(control of male mice,Con-M)、雌鼠对照组(control of female mice,Con-F)、雄鼠复方精油剂量1组(compound essential oil dose 1 of male mice,Dose 1-M)、雌鼠复方精油剂量1组(compound essential oil dose 1 of female mice,Dose 1-F)、雄鼠复方精油剂量2组(compound essential oil dose 2 of male mice,Dose 2-M)、雌鼠复方精油剂量2组(compound essential oil dose 2 of female mice,Dose 1-F),每组8只。复方精油剂量1和剂量2的浓度为1.48×10-4、2.07×10-4mL/cm3,分别为复方精油有效剂量(5×10-7mL/cm3)的296倍和414倍。对照组吸嗅等量蒸馏水,实验开始1 d,单次吸嗅15 min(30 cm×30 cm×30 cm箱体),为确保规定时间内精油完全雾化,采用多个雾化器同时雾化。

给药当天仔细观察并记录动物的中毒表现,症状出现和消失的时间及死亡时间。给药当日连续观察,其后每日1次,连续观察14 d。观察期间记录小鼠的体重变化、外观征、行为活动、呼吸,饮食,排泄物等及其他中毒表现,若有动物死亡,进行肉眼观察和尸检,必要时病理学检查。观察期结束第14 d,对各组小鼠眼眶取血并进行血常规分析和谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐和尿素氮含量检测,取各组小鼠脑、肺、鼻黏膜、肝、肾进行组织病理学切片分析。

1.3.6 统计学处理方法

2 结果

2.1 复方精油吸嗅对小鼠自主活动能力的影响

如图1所示,给药1 d,与对照组比较,阳性药组(咖啡因)和复方精油组(低、中、高剂量组)小鼠的运动总距离均显著增加(P<0.01,P<0.01),平均速度均显著提高(P<0.01),休息时间显著缩短(P<0.01),表明不同剂量复方精油可以显著提高昆明小鼠的自主活动能力,具有振奋精神的作用。给药2 d,实验结果与给药1 d基本一致。给药3 d,与对照组比较,阳性药组小鼠的运动总距离、平均速度和休息时间均无显著性差异(P>0.05),复方精油组(低、中、高剂量组)运动距离均显著增加(P<0.01),平均速度显著提高(P<0.01),休息时间显著缩短(P<0.01)。

图1 复方精油对昆明小鼠自主活动能力的影响Fig.1 Effect of compound essential oils on autonomic activity of Kunming mice 注:a:对照组,b:阳性药组,c:复方精油低剂量组,d:复方精油中剂量组,e:复方精油高剂量组。与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:a:Control group,b:Positive drug group,c:Compound essential oil low dose group,d:Compound essential oil medium dose group,e:Compound essential oil high dose group.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 戊巴比妥钠阈上睡眠诱导实验结果

如图2所示,与对照组比较,阳性药组(咖啡因)和复方精油组(低、中、高剂量组)对小鼠的睡眠潜伏期无显著性差异(P>0.05,P>0.05);阳性药组(咖啡因)和复方精油组(低、中、高剂量组)均能显著缩短小鼠睡眠时间(P<0.05,P<0.01),说明复方精油吸嗅具有良好的促醒作用。

图2 戊巴比妥钠睡眠诱导实验结果Fig.2 Results of sleep induction experiment with pentobarbital

2.3 复方精油对小鼠脑内和血清GLU、DA含量的影响

如图3所示,与对照组相比,复方精油组(低、中、高剂量组)显著增加脑内多巴胺水平(P<0.05),咖啡因对脑内多巴胺水平没有显著影响(P>0.05),阳性药组(咖啡因)和复方精油组(低、中、高剂量)均显著提高脑内谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05),复方精油组(低、中、高剂量组)显著增加血清多巴胺水平(P<0.05),咖啡因对血清多巴胺水平具有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05),阳性药组(咖啡因)和复方精油组(中、高剂量)均显著提高血清谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05)。DA和GLU含量的增加可能是复方精油吸嗅促进小鼠自主活动能力、提神醒脑的重要作用机制。

图3 复方精油对昆明小鼠血、脑组织GLU、DA的影响Fig.3 Effect of compound essential oil on GLU and DA in blood and brain of Kunming

2.4 复方精油对昆明小鼠不同脑区多巴胺受体D1R表达的影响

如图4所示,与对照组比较,复方精油组(低、中、高剂量组)显著提高昆明小鼠不同脑区(海马、下丘脑、前额皮层和其他脑组织)的D1R表达(P<0.05),阳性药组(咖啡因)对海马、下丘脑组织中的D1R表达无显著影响,阳性药组(咖啡因)显著提高前额皮层和其他脑组织的D1R表达(P<0.05)。

图4 复方精油对昆明小鼠不同脑区多巴胺受体D1R表达的影响Fig.4 Effect of compound essential oil on the expression of dopamine receptor D1R in different brain regions of Kunming

2.5 复方精油GC-MS成分分析

GC-MS分析的复方精油主要化学成分及相对百分比见表1,总离子流图见图5。共鉴定并核实31种化学成分,占挥发油总成分的84.41%,其中含量最高的为L-薄荷醇(24.54%),其次为丁香酚(16.25%)、L-薄荷酮(7.78%)、冰片(7.30%)、1-石竹烯(5.29%)、1,8-桉叶素(3.40%)等。

图5 复方精油总离子流图Fig.5 Total ion chromatogram of compound essential oil

2.6 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠安全性研究

2.6.1 复方精油高浓度单次吸嗅小鼠外观表征

实验观察,在高浓度吸嗅过程中,复方精油剂量1组和复方精油剂量2组小鼠均存在跳跃行为,吸嗅5 min左右最为明显。吸嗅15 min后,对照组、复方精油剂量1组和复方精油剂量2组小鼠除毛发较为湿润外,无其他明显异常表现,呼吸和运动正常。

2.6.2 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠体重的影响

结果见表2,与对照组比较,复方精油高浓度单次吸嗅,观察期14 d内,复方精油不同剂量给药组小鼠体重无显著性差异。

表2 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠体重的影响

2.6.3 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠血细胞的影响

结果见表3,与对照组比较,复方精油高浓度单次吸嗅,复方精油不同剂量给药组对小鼠血细胞无显著性差异。

表3 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠血细胞的影响

2.6.4 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠肝肾功能的影响

结果见表4,与对照组比较,复方精油高浓度单次吸嗅,不同给药小鼠组谷草转氨酶、胱抑素、谷丙转氨酶、肌酐和尿素氮无显著差异(P>0.05)。

表4 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠肝肾功能的影响

2.6.5 复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠脑、鼻黏膜、肺、肝、肾的影响

结果见图6～10,与对照组正常小鼠比较,复方精油剂量1和复方精油剂量2对雄性或雌性小鼠的脑、鼻黏膜、肺、肝、肾等组织无明显病理性损伤,各组织细胞核明显,未见炎性浸润、细胞破裂等细胞组织损伤。

图6 脑组织HE染色病理切片(×200)Fig.6 HE stained pathological section of brain tissue (×200)注:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,下同。Note:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,the same below.

图7 鼻黏膜HE染色病理切片(×200)Fig.7 HE staining pathological section of nasal mucosa (×200)

图8 肺HE染色病理切片(×200)Fig.8 HE staining pathological section of lung (×200)

图9 肝HE染色病理切片(×200)Fig.9 HE stained pathological section of liver (×200)

图10 肾HE染色病理切片(×200)Fig.10 HE stained pathological section of kidney (×200)

3 讨论与结论

自主活动是评价动物情绪兴奋性的重要方法,自主活动的增加表明兴奋性增强[9]。实验动物自主活动的减少、睡眠时长的增加、睡眠潜伏期的缩短被用于评价药物的镇静安神抗失眠作用,而与该表征相反的结果则被认为具有提神醒脑、促醒的功效[5]。咖啡因是目前运用最广且普遍认可的精神兴奋剂,具有中枢兴奋和提神醒脑的作用,同时咖啡因也是多种提神功能性饮料的主要药效成分,给药方式的不同,药效及起效时间存在差异,相比于吸嗅给药,口服给药起效较慢,本文预实验结果表明咖啡因灌胃给药后30 min较为兴奋,自主活动能力显著增强,戊巴比妥钠阈上睡眠诱导实验也表明给药30 min后睡眠总时长显著缩短,因此本文中阳性药组咖啡因选择灌胃给药后30 min进行相关指标检测。吸嗅发挥药效的速度较快,预实验结果表明复方精油吸嗅15 min后自主活动能力显著增强,因此选择吸嗅15 min后进行相关指标检测。有文献选择薄荷油吸嗅为阳性对照组,但是因复方精油中含有薄荷油,因此本文没有选择薄荷油作为阳性药,而选择公认具有提神醒脑功效的咖啡因作为阳性药。旷场实验结果表明,复方精油单次或多天给药均能显著提高小鼠自主活动能力,具体表现为提高正常小鼠运动距离和平均速度,缩短休息时间,同时,与阳性药咖啡因比较,复方精油提高小鼠自主活动能力药效更显著、更持久。戊巴比妥钠阈上剂量睡眠诱导实验结果表明,复方精油不同剂量组均能够显著减少昆明小鼠的睡眠时间,具有促醒的作用。分析以上结果可知,复方精油吸嗅能有效促进正常小鼠自主活动、缩短戊巴比妥钠睡眠诱导时长,发挥持续提神醒脑的功效。

DA和GLU是重要的兴奋性神经递质,多巴胺被认为是一种促进觉醒和兴奋的物质[10],多巴胺的增加有利于维持清醒和增强兴奋性,多巴胺激动剂和多巴胺再摄取抑制剂是治疗发作性睡病的重要药物类型,DA还参与运动、动机和奖励机制的调节[11]。谷氨酸神经元是唤醒和睡眠回路中主要神经元的重要组成部分,GLU含量的增加有助于唤醒和兴奋,GLU水平的高低在一定程度上反映小鼠的神经活动兴奋性的强弱[11]。本研究发现,复方精油吸嗅能显著提高小鼠血、脑内DA、GLU含量,与相关报道结果一致。据报道,大麻二酚和莫达非尼精神兴奋剂可通过增加脑组织DA等神经递质水平,促进灯开启期间诱导大鼠觉醒[12],咖啡因、大麻及它们的组合在治疗后增加大脑组织中的GLU水平,GLU水平的增加可能会激活小鼠骨髓细胞核中的组胺神经细胞,并增加其活力[13]。因此,DA、GLU含量的增加可能是复方精油促进小鼠兴奋的重要原因之一。本研究发现咖啡因对DA无显著影响,咖啡因与复方精油对GLU和DA的差异可能为机制上的差异。据报道,咖啡因的兴奋作用主要通过腺苷受体拮抗、兰尼碱受体结合激活兰尼碱敏感型钙通道、抑制γ-氨基丁酸(GABA)与受体结合和抑制环核苷酸磷酸二酯酶的活性等4种途径实现。D1R是DA的重要受体之一,参与运动、奖赏和学习记忆的调节[14]。DA对运动神经元兴奋性的大部分影响归因于D1R的激活[15],因此复方精油提高小鼠自主活动可能与上调D1R蛋白水平有关。另外,DA在唤醒中起着重要作用,因此复方精油导致小鼠睡眠时间缩短的原因可能是D1R介导的唤醒机制的激活[16]。

GC-MS成分分析结果表明,L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉叶素等成分是复方精油的主要成分。薄荷醇是薄荷精油的主要有效成分,约占薄荷精油33%～60%,薄荷醇可以有效改善认知和缓解精神疲劳,Zhang等[17]的研究表明,单独使用薄荷醇不会影响大鼠伏隔核中DA的水平,而尼古丁和薄荷醇联合使用与单独使用尼古丁相比,显著提高了DA的水平,因此复方精油中的薄荷醇与精油中的其他成分联合应用提高小鼠脑内DA水平发挥兴奋作用。丁香酚为丁香精油的主要成分,丁香酚具有强抗氧化活性,能有效缓解机体的氧化应激损伤,能有效提高机体抗氧化酶活性,丁香酚还具有学习记忆功能改善作用。L-薄荷酮在抗抑郁和抗炎方面具有相关报道[18],冰片作为开窍醒脑的常用药,具有引药上行和神经保护作用,1-石竹烯具有抗炎和神经保护作用,Han等[19]研制的复方精油具有缓解大鼠中枢疲劳的作用,其中精油中含有33.8%的1,8-桉叶素。因此复方精油吸嗅提神醒脑改善疲劳可能是多种成分共同作用的结果。

单次给药急性毒理学实验是考察药物安全性的重要手段之一[20]。为评价精油吸嗅的安全性,我们在有效剂量的基础上进一步提高给药剂量,进行单次吸嗅给药急性毒理学实验。实验结果表明,复方精油高浓度单次吸嗅对小鼠体重、血细胞、谷草转氨酶、胱抑素、谷丙转氨酶、肌酐和尿素氮无显著性影响,同时对小鼠的脑、鼻黏膜、肺、肝和肾等重要组织器官无病理损伤,说明复方精油吸嗅安全性良好。

综上所述,复方精油通过提高小鼠血、脑组织DA、GLU含量,上调小鼠海马、下丘脑、前额皮层和其他脑组织D1R的蛋白水平表达,发挥提高小鼠自主活动能力以及促醒的作用。复方精油的主要有效成分可能为L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉叶素。单次给药急性毒性实验结果表明,复方精油吸入对昆明小鼠体重、血细胞相关指标、肝肾功能均无显著性影响,对脑、鼻、肺、肝、肾等组织无病理性损伤,说明复方精油吸入安全性良好,可以作为提神醒脑的安全性产品使用。