分子生物学技术在鸟类亲缘关系研究中的应用

李 健

（四川省屏山县老君山国家级自然保护区保护中心，四川 屏山 645350）

鸟类的亲缘关系不能只根据鸟类的外形和行为来判断，比如鲜艳的蜂鸟和褐色的欧夜莺这两种迥然不同的鸟类就有亲缘关系。有些鸟类差异过大，从未被联想在一起，但科学证明它们的确是近亲，例如常见的鹦鹉和不常见的鸣鸟。而那些行为习惯较为相似的鸟类，比如猎隼和其他食肉猛禽，在基因上可能没有关联性。为阐述分子生物科学在鸟类亲缘关系领域的应用，本文简要介绍了几种生物分子技术。

1 同工酶和蛋白电泳技术

随着蛋白质电泳技术的发展，人们对蛋白质的多态性进行了深入的研究。该方法利用特定的电泳载体，将同工酶和非酶体蛋白的电荷性进行区别，分离出不同的基因座，或相同位点的不同等位基因，以实现对基因型的识别。传统的同工酶检测技术是通过横向切片的淀粉凝胶电泳法或高分辨率的纵向板状聚丙烯酰胺凝胶电泳法来实现的（见图1）。试验必须在低温环境中进行，需确保样品的新鲜度或利用低温冷冻组织，再进行萃取；电泳时要确保环境温度适宜，在低温操作过程中维持酶和蛋白的活性。蛋白质电泳技术仅能探测到编码蛋白的基因位点，不能测出某些潜在的变异性，可能会低估遗传变异程度，这对研究近亲群体的遗传差异有不利影响；而且，可分析的同工酶种类也很少。虽然有以上缺点，但其成本低、设备简单、操作快捷，在基因多样性的研究中仍有广阔的应用前景。

图1 水平式（A）和垂直式（B）平板凝胶电泳图解

2 随机扩增多态DNA 分析

随机扩增多态DNA 技术是一种新的DNA 分子结构分析方法。该方法基于PCR 技术，以10 bp的短寡核糖核酸单链作为引子，且这种核糖核酸单链是按照碱基顺序随意排序的，通过这种方法可使基因组DNA 扩增，便于利用PCR 技术对扩增物进行试验和观察。然后用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳法分离扩增物，用溴化乙锭染色，对其DNA片段进行多态性分析。RAPD 技术能快速检测DNA的多态性，无需对该品种进行任何分子生物学的研究，且检测效率高，样品用量少，灵敏度高，操作简单快捷，成本低，所以能在近亲样品中扩大不同的带型。这项技术自威廉姆斯和威尔士两个研究小组于1990 年共同开发以来，已经在遗传多样性、分类和进化等领域得到了广泛的应用。但是，RAPD 技术的，应用也有不足之处，该技术对环境要求较高，反应易受外界因素影响，重复性和可比性较差，经济效益一般。

3 DNA 序列分析

DNA 一级序列是基因遗传多样性的根本体现，是一种最直接的遗传反映。PCR 技术的问世降低了科学研究人员的工作量，使PCR 产物的直接测序过程不再复杂繁琐；还使DNA 序列分析结果更适合于揭示群体的差异。在DNA 序列分析法中，需要对动物线粒体DNA（mtDNA）进行分析，它是一种共价闭环的双链DNA，它是一种以母系遗传为主的独立复制体系，进化速度是单拷贝核DNA 的5～10倍，已经成为近缘物种与种内群体遗传关系研究的重要标志，因此，经常利用mtDNA 序列来分析鸟类的亲缘关系。

路基尼和兰迪利用mtDNA 调控区进行序列分析，对70 只来自不同区域的欧洲石鸡进行了研究。索伦森等人也从一种已绝迹的鸟类的骨头中提取mtDNA，用PCR 技术对其进行了扩增，并对其序列进行了序列分析。再比如，内蒙古大学生命科学院对12 种雀形目鸟类进行了四种碱基比例电泳检测，获得12 对SrRNA 序列，通过实验过程中的保守位点、转换位点、颠换位点的计算，得到A、T、G、C四个碱基的变异具情况（见表1）。最后再利用MEGA 软件进行比对，测算出这12 种雀形目鸟类的遗传距离。

表1 12SrRNA 序列三位点变异

最后得到的结果较为准确，比如长尾山雀到山雀科鸟类的距离是0.1114～0.1198；白腰朱顶雀与白翅交嘴雀的遗传距离为0.0028；猎隼到长尾山雀的遗传距离是0.5599......

4 DNA 指纹分析

DNA 指纹的研究建立在 DNA 序列中的高变区上，而这种高变区又叫做“小卫星DNA”。杰弗里斯等人的研究表明，在不同的DNA 片段中，小卫星DNA 的复制单元具有不同的长度和顺序，但其核心的片段是同一的。不同的群体间存在着明显的差异，DNA 探针与含有核心序列的小卫星DNA 杂交，形成含多条圈带的杂交图谱，因为不同个体之间的杂交图谱不同，表现出个体特异性，而且像人类的指纹一样独一无二，因人而异，所以我们称之为DNA 指纹，其构建过程（见图2）。

图2 DNA 指纹的构建过程

相对于小型卫星，基因组具有更多的随机分布的微卫星，因而可以提供更多的随机分布的分子遗传标记。DNA 指纹图谱的特征是：多位点性、高变异性、基因结构简单、遗传稳定性好，而多位点DNA指纹图谱包含许多不同的图带，技术检测与数据分析方面都比较复杂。要想简化数据统计和分析，可以利用DNA 指纹分析，一些小、微型卫星探针分别与各自的等位基因进行杂交，就会得到一个包含1～2 条图带的图谱，即DNA 指纹图样，这时若一次仅对个别小、微卫星位点进行分析，统计起来就会比较省力、简便。

PCR 是DNA 聚合酶链反应，可以在细胞外大规模进行DNA 的增殖的新型技术手段。当难以得到传统Southern 杂交所需的DNA 数量时，可以通过PCR 技术进行DNA 的扩增（见图3）来满足试验需求。在对微卫星、小卫星进行测序后，利用PCR技术对其进行特异性扩增，从而确定其变异程度。采用PCR 技术和局部酶切技术，可以对多个重复单位进行多次变异分析。DNA 指纹分析技术不仅能够有效研究鸟类亲缘关系，在人类亲子鉴别中也具有很大的实用意义，排除基因突变，后代DNA 指纹图上的每一条带都可以在父亲或是母亲的遗传图谱上找到，而在后代中往往会有少数由遗传变异所形成的新带。

图3 PCR 技术进行DNA 扩增的过程示意图

5 结 语

所述几种鸟类亲缘关系生物学验证方法各有利弊，要结合实际情况和实验目的，选用最合适的方法。在不改变试验参数和标准的前提下，为保证试验的可靠性可以采用多种不同的组合方法。虽然上述方法可以帮助我们对鸟类的亲缘关系、生殖特性等进行准确的研究，但从分子生物学的角度来看，结论往往存在不完善之处，所以必须将其应用于实际的宏观生物学研究中。随着分子生物学技术的不断发展，其在鸟类科学领域的应用将会越来越广泛。