基于UPLC-Q-TOF-MS 和网络药理学探讨黄精糕干预2 型糖尿病的作用机制

孙医慧，王祥斌，李俊明，陈光宇，谢梦洲*，李 亮*

1.湖南中医药大学湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

糖尿病是以胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗造成慢性血糖水平增高为特点的代谢疾病[1]。T2DM（type 2 diabetes mellitus, T2DM）是糖尿病中最主要的类型，约占糖尿病患者总数的90%[2]。 临床治疗糖尿病大致分为口服降糖药和注射胰岛素两个方案[3]，但使用时有着严格的适应证和禁忌证，长期服用多伴有毒副作用及不良反应[4]。 近年来，药食同源产品由于辅助治疗作用确切，安全性高且味道较好，适合长期服用，在市场上逐渐受到消费者的青睐，对大众保健、康复、营养起到了积极的作用[5-6]。 研发一款由药食同源中药组成且适用于T2DM 及其并发症的产品，具有社会意义和经济价值。

黄精糕是由黄精、玉竹、山药、枸杞子、桑椹、覆盆子共6 味药食同源中药组成，经提取、浓缩、干燥制成的干浸膏粉[7]。 T2DM 属中医学“消渴病”范畴，消渴病病机为阴虚燥热，治宜养阴生津、润燥清热。根据2020 年版《中华人民共和国药典》[8]，黄精补气养阴、健脾、润肺、益肾；玉竹养阴润燥、生津止渴；枸杞子滋补肝肾、益精明目；桑椹滋阴补血、生津润燥；山药补脾养胃、生津益肺、补肾涩精；覆盆子益肾固精缩尿、养肝明目。 以上6 味中药合用有补气养阴、润燥生津的功效，符合消渴病的病机、治则。 据文献报道，黄精、玉竹、山药、枸杞子、桑椹中的多糖类成分、 皂苷类成分及覆盆子中的覆盆子酮等成分皆有降血糖及降血脂作用[9-16]，山药、玉竹含有的黄酮类成分具抗氧化作用，可有效降低血糖水平[17-18]。

中药复方的化合物成分多样，对应靶点多，通路多，作用机制不明确。 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS）技术具有灵敏度高、精准度高、扫描范围广的特点，可以有效识别中药复方中的各种化学成分[19]。网络药理学通过构建药物-药物、药物-靶标等网络，能够有效预测药物的功效[20]。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS 和网络药理学分析黄精糕干预T2DM 的作用靶点与通路，参照保健食品“辅助降血糖功能评价方法”[21]中的方案，研究黄精糕降血糖、降血脂、抗氧化的作用，为黄精糕产品开发提供科学依据。

1 材料

1.1 主要仪器

Exion LC AD 型超高效液相色谱仪、X-500R型飞行时间四极杆质谱仪（美国AB Sciex 公司）；i-MarK 型酶标仪（伯乐生命医学产品上海有限公司）；UV900B 型紫外-可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；GA-3 型血糖仪、配套试纸条、一次性采血针（三诺生物传感股份有限公司）。

1.2 药物与主要试剂

链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：s5080，规格：1 g/瓶）；盐酸二甲双胍缓释片（正大天晴药业集团，批号：201229302，国药准字：H20031104，规格：0.5 g×60片）；生理盐水（江西科伦药业有限公司，批号：20050701，国药准字：H10983065，规格：500 mL）；10%水合氯醛（福州飞净生物科技有限公司，批号：PH1818，规格：100 mL）。 血糖试剂盒、总胆固醇（total cholesterol, TC）试剂盒、 低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）试剂盒、甘油三酯（triglyceride, TG）试剂盒，丙二醇（malondialdehyde, MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）试剂盒、胰岛素试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：F006-1、A111-1、A113-1、A110-1、A003-1、A001-3、H203-1）。

黄精、玉竹、山药、枸杞子、桑椹、覆盆子中药饮片购自湖南省新化县绿源农林科技有限公司，经湖南中医药大学王智老师鉴定为正品。

1.3 黄精糕样品制备

黄精糕由黄精10 g、玉竹4 g、山药4 g、枸杞子4 g、桑椹4 g、覆盆子4 g 组成，以上药材加入12 倍量70%乙醇提取1 次，15 kPa 压力下60 ℃提取90 min，再分别加水12 倍、10 倍提取120 min、90 min（温度90 ℃，压力7 kPa），得到黄精糕提取液。 黄精糕提取液经50 ℃减压浓缩至1.05 g/mL，冷冻干燥制成黄精糕干浸膏粉。

2 方法

2.1 黄精糕化学成分分析

2.1.1 色谱条件和质谱条件 色谱条件：WATERS ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μL），以甲醇溶液为流动相A，以0.1%甲酸为流动相B；柱温25 ℃；流速0.3 mL/min；梯度洗脱：0～10 min，10% A；10～45 min，10%→90% A；45～49 min，90% A；49～50 min，90%→10% A；50～60 min，10% A。

质谱条件：采用电喷雾离子化（electrospray ionization, ESI），正、负离子模式；除溶剂气体温度550 ℃；毛细管电压5.0 kv；气帘气压力35 psi；喷雾气压力50 psi；辅助气压力50 psi；扫描范围100～1 000 m/z。

2.1.2 空白对照液与黄精糕供试液制备 空白对照液的制备：取超纯水，离心10 min（12 000 r/min，离心半径12 cm），即得；黄精糕供试液的制备：取黄精糕干浸膏粉约0.1 g，精密加入10 mL 水，超声（200 W，50 Hz）60 min，高速离心10 min（12 000 r/min 离心半径12 cm），取上清液，即得。

2.1.3 质谱分析 精密吸取空白对照液、黄精糕供试液各10 μL，注入液质联用仪，分析各供试液成分。 黄精糕供试液的液质总离子流图（正、负离子），详见图1。

图1 黄精糕供试液的液质总离子流图

2.2 网络药理学研究

2.2.1 黄精糕活性成分靶点筛选 在PubChem 数据库下载各活性成分sdf 文件，在SwissTargetPrediction 数据库预测各活性成分作用靶点，删除重复值。

2.2.2 T2DM 靶点搜集与筛查 在GeneCards 数据库以“diabetes mellitus type 2”为关键词筛选疾病靶点。 用Venny 2.1.0 将疾病靶点与黄精糕活性成分预测作用靶点去重并取交集。

2.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein in teraction, PPI）网络构建与分析 将共同基因导入STRING 11.5，限制物种为“Homo sapiens”，置信度为0.09，进行PPI 分析。 将药物与疾病共同靶点导入Cytoscape 3.8.0 构建“成分-靶点”网络图。对节点度值进行分析、排序，确定黄精糕干预T2DM 的核心靶点。

2.2.4 基因本体（gene ontology, GO）富集分析与京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析 将“2.2.3”获取的靶点导入DAVID 6.8 平台进行GO 功能与KEGG通路分析。

2.3 动物实验验证

2.3.1 动物与饲料 SPF 级雄性SD 大鼠72 只，体质量180～200 g，由湖南中医药大学实验动物中心订购[许可证号：SYXK（湘）2019-0009]，饲养于湖南中医药大学SPF 级实验动物中心（伦理审批编号：LL2021061602）。 高脂高糖饲料由湖南中医药大学实验动物中心订购，饲料组成为：10%猪油、20%蔗糖、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆酸钠、58.8%鼠维持料。

2.3.2 T2DM 大鼠模型的构建 72 只雄性大鼠给予普通饲料适应性饲养3 d 后，随机选取12 只作为正常组，给予普通饲料喂养，剩余60 只给予高脂高糖饲料喂养30 d 后，禁食（不禁水）12 h，于次日称重。以40 mg/kg 的剂量腹腔注射STZ 溶液，继续高脂高糖饲料喂养3 d 后，再次禁食（不禁水）12 h，尾静脉采血测定空腹血糖。 大鼠造模成功的标准为：空腹血糖≥11.1 mol/L[22]。 未造模成功的大鼠，继续高脂高糖饲料喂养3 d 后禁食，检测空腹血糖。 仍未达标者，再次腹腔注射等剂量的STZ 溶液，直至所有大鼠造模成功。

2.3.3 分组与给药 造模成功的大鼠随机分成模型组，黄精糕低、中、高剂量组，二甲双胍组（成人1 日1 次最大剂量2 000 mg，最低剂量500 mg，取中剂量1 250 mg，换算成大鼠的灌胃量为112.5 mg/kg）。大鼠黄精糕灌胃剂量通过人-动物体表面积换算公式[23]，全方30 g，按照70 kg 成人的临床剂量为30 g/70 kg，换算为大鼠用量2.7 g/kg，此剂量作为低剂量，中、高剂量分别为5.4、10.8 g/kg。 黄精糕低、中、高剂量组给予黄精糕提取液，二甲双胍组给予二甲双胍溶液，模型组、正常组给予生理盐水（10 mL/kg），每日定时给药1 次，连续给药30 d。

2.3.4 指标检测 造模成功后，所有大鼠每隔1 周进行空腹血糖检测。 检测时，提前禁食（不禁水）12 h，尾静脉针刺采血测定血糖。 腹主动脉取血5 mL，3 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm，分离得到血清。 按照各试剂盒要求，酶标仪比色法分别测定LDL-C、TG、TC、MDA、SOD 指标，ELISA 法测定血清胰岛素含量。

2.3.5 数据分析 各样品检测结果用DPS 统计软件进行异常值检验，剔除各组异常指标后再进行统计。 符合正态性和方差齐性者采用完全随机设计多样本单因素方差分析，不符合正态性或方差齐性采用多样本秩和检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄精糕主要化学成分

通过UPLC-Q-TOF-MS 技术分析得到黄精糕中87 个成分，主要包括柠檬酸、甜菜碱、D-蔗糖、D-葡萄糖、葡萄糖酸等，详见表1。预测87 个成分可以作用于1 113 个靶点，筛除重复靶点后剩余434 个靶点。

表1 黄精糕中化学成分

3.2 T2DM 与黄精糕交集靶点的获取

在GeneCards 数据库获得T2DM 靶点1 186个。 用Venny 2.1.0 将疾病靶点与黄精糕活性成分作用靶点去重取交集，获得160 个交集靶点。 详见图2。

图2 T2DM 与黄精糕交集靶点的Veen 图

3.3 PPI 网络的构建与分析

根据PPI 网络图，获取黄精糕治疗T2DM 的核心靶点，根据靶点的度值进行排序，前10 位分别为：STAT3、SRC、MAPK3、VEGFA、MAPK1、TNF、PPARA、NR3C1、RXRG、HSP90AA1。 详见图3。

图3 黄精糕化合物作用于T2DM 靶点的PPI 网络图

3.4 GO 富集分析与KEGG 通路富集分析

GO 功能分析得到基因生物过程（biological process, BP）571 条， 主要涉及ERK1 和ERK2 级联的正向调控、MAP 激酶活性的正向调节、药物反应、低氧反应、平滑肌细胞增殖的正向调节等；获得细胞组成（cell composition, CC）78 条，主要为质膜、细胞外泌体、膜筏面等；获得分子功能（molecular func tion, MF）144 条，主要为酶结合位点、转录因子活性、蛋白结合等；根据P 值进行排序后，取前5 位进行可视化。 详见图4。

图4 黄精糕潜在干预T2DM 靶点的GO 富集分析

将KEGG 通路富集分析按显著性排序，取前10位进行展示。共同靶点主要与脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 等信号通路相关（图5）。由此可见，黄精糕可以通过多个生物机制达到治疗T2DM 的效果。 其中糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路可能为关键作用通路（图6）。

图5 黄精糕潜在干预T2DM 靶点的KEGG 富集分析

图6 黄精糕成分作用于T2DM 并发症中的AGE-RAGE 信号通路的作用靶点

3.5 黄精糕对T2DM 大鼠血脂的影响

与正常组比较，模型组血清中TC、LDL-C、TG含量显著升高（P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，各给药组血清中TC、LDL-C、TG 含量均显著降低（P＜0.01)。 与二甲双胍组比较，黄精糕低剂量组TG降低（P＜0.05）。 详见图7。

图7 各组大鼠血脂比较

3.6 黄精糕对T2DM 大鼠血糖及血清胰岛素的影响

与正常组相比，模型组血糖显著升高（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，黄精糕高剂量组、二甲双胍组血糖显著降低（P＜0.01），黄精糕低剂量组血糖降低（P＜0.05）。

与正常组相比，模型组血清胰岛素显著降低（P＜0.01）。 与模型组相比，黄精糕中、高剂量组及二甲双胍组血清胰岛素均显著升高（P＜0.01），黄精糕低剂量组血清胰岛素升高（P＜0.05）。 详见图8。

图8 各组大鼠血糖及血清胰岛素比较

3.7 黄精糕对T2DM 大鼠血清SOD、MDA 的影响

与正常组相比，模型组血清中SOD 含量显著降低、MDA 含量显著升高（P＜0.01）。 与模型组比较，各给药组血清中SOD 含量显著升高、MDA 含量显著降低（P＜0.01）。 详见图9。

图9 各组大鼠血清中SOD、MDA 比较

4 讨论

T2DM 是一种以糖脂代谢紊乱为特征的疾病，主要由环境因素及遗传因素引起，目前认为其主要发病机制为胰岛素抵抗及胰岛β 细胞功能障碍[24]。中医学认为，消渴病多饮、多食、多尿、体重减轻、神疲乏力等症状的病机是阴液亏损，燥热偏盛。 黄精糕有补气养阴、润燥生津的功效，符合消渴病治则。且T2DM 有明显高发性和低龄化趋势[25]，药食同源产品在早期干预与长期调理中有无毒副作用的独特优势。

本研究通过UPLC-Q-TOF-MS 技术联合网络药理学和动物实验验证的方式，证明了黄精糕有降血糖、降血脂、抗氧化的作用，并从有效成分、蛋白靶点和通路等方面综合探索、预测黄精糕干预T2DM的机制。 在UPLC-Q-TOF-MS 技术分析得到的黄精糕成分中，柠檬酸、甜菜碱、D-蔗糖、D-葡萄糖峰面积百分比较高。动物实验证明，柠檬酸可以改善高脂血症动物的糖代谢紊乱[26]，甜菜碱可降低瘦素受体缺陷型小鼠血糖、血脂水平[27]。本文分析出D-蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、阿拉伯糖、五水棉子糖、果糖等不同糖成分。 其中D-蔗糖、D-葡萄糖是黄精多糖中的单糖和寡糖成分[28]，D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖是玉竹多糖组成成分[29]，阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖是山药多糖的组成成分[30]。黄精、玉竹、山药的多糖可有效降低血糖、血脂[9-11]。 鞣花酸是2020 版《中华人民共和国药典》中覆盆子判别质量的成分之一，可降低糖尿病模型小鼠的血糖水平[31]。以上都是黄精糕发挥降血糖、血脂作用的关键成分。

通过PPI 网络分析得出，SRC、STAT3、VEGFA、TNF、PPARA 5 个靶点排名靠前，与黄精糕中的活性成分结合度较高。 说明黄精糕的活性成分与以上靶点结合度较高。 研究发现，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）作为细胞因子，可以参加多种炎症与免疫反应，诱导胰岛β 细胞凋亡[32]，进而引发T2DM。 PPARA 是过氧化物酶体增殖物激活受体中的一个亚型，与脂代谢关系密切，PPARA 可以调节血糖稳态，维持脂质代谢平衡[33]。 VEGFA 是内皮细胞在体内和体外的生存因子，GAO 等[34]通过实验证明，VEGFA 与高糖诱导“代谢记忆”存在关联，参与T2DM 的病理过程。 SRC 在细胞增殖、分化等细胞过程中发挥作用，核受体共激活因子1（nuclear receptor coactivator 1, SRC1）不仅是肥胖的潜在治疗靶点，也是糖尿病的潜在治疗靶点[35]。 研究表明，抑制STAT3 的活化可以改善由高血糖引起的心脏功能障碍和心脏纤维化[36]。 根据以上研究，证明PPI网络筛选出的靶点与T2DM 关系紧密，TNF、VEGFA、SRC、STAT3、PPARA 可能是黄精糕干预2 型糖尿病的关键靶点。 KEGG 通路富集结果表明，黄精糕与T2DM 的共同靶点主要与脂质和动脉粥样硬化、癌症、雌激素、AGE-RAGE 在糖尿病并发症中的信号通路、HIF-1 等信号通路相关。 实验证明，胰岛素抵抗大鼠模型的骨骼肌中AGE、RAGE 的表达量上调，说明高血糖状态下可以导致AGE、RAGE 的积累，AGE、RAGE 广泛参与多种生理、病理过程[37]。 根据AGE-RAGE 信号通路结果可以得出，AGE/RAGE 信号引发多种细胞内信号通路的激活，导致NF-κB活性增强，NF-κB再促进促炎细胞因子和多种动脉粥样硬化相关基因的表达，最终引发糖尿病并发症。 AGE-RAGE 信号介导的糖尿病并发症包括糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病血管并发症和糖尿病足综合征。

动物实验结果表明，黄精糕能显著降低T2DM大鼠血清中的LDL-C、TG、TC 含量，有显著的降脂作用，黄精糕各剂量组的降脂效果与二甲双胍组的效果相当。 黄精糕各剂量组对T2DM 大鼠有升高血清胰岛素含量、降低血糖的作用。 黄精糕可提高SOD 活力、降低MDA 含量，有效改善T2DM 大鼠的抗氧化能力，这也是降低血糖的机制之一。 TC 是指血液中各种脂蛋白所含胆固醇的总和，当TC 单独升高，可以诊断为高胆固醇血症。 载脂蛋白糖化LDLC 后会促进巨噬细胞对其的吞噬，从而加速血管壁的斑块形成，增加心脑血管疾病风险。 TG 是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，TG 升高是心血管剩留风险的重要组分，美国国立卫生研究院资助的控制糖尿病心血管患者风险行动中的血脂分享研究显示，在T2DM 患者中，TG 增高和高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein, HDL）降低的患者与TG 正常人群相比，心血管剩留危险增加70%[38]。 心血管疾病是T2DM 患者主要和最常见的死亡原因，因此，T2DM患者除血糖外还要重点关注自身LDL-C、TG、TC 水平。

结合网络药理学预测结果，黄精糕可能通过多靶点、多环节调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，从而降低血糖、血脂水平，降低糖尿病并发症的风险，起到干预T2DM 的作用。

综上所述，经动物实验验证，黄精糕可以改善T2DM 大鼠血糖、血脂水平等指标发挥干预T2DM的作用。 根据UPLC-Q-TOF-MS 及网络药理学结果分析，黄精糕可能由多种活性成分如黄精多糖、玉竹多糖、鞣花酸等，通过调节TNF、VEGFA、SRC、STAT3、PPARA 等靶点，调控AGE-RAGE 信号通路、干预T2DM。 本研究可为黄精糕产品研发提供依据，为后续研究提供思路。