耐低营养乳酸菌筛选及对难青贮牧草发酵品质的影响

田静，曹彩霞，黄莉莹，吴娟燕，张建国

（1. 华南农业大学南方草业中心，广东 广州 510642；2. 韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005；3. 广东科贸职业学院继续教育学院，广东广州 510430）

青贮是依靠原材料本身附着的乳酸菌在厌氧条件下将原材料中水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrates，WSC）转化为以乳酸为主的有机酸，降低pH，抑制腐败微生物的生长和繁殖，使青贮饲料营养物质得以长期保存的技术[1］。青贮饲料因气味香甜、柔软多汁、营养保存好、适口性佳等特点，被世界各国所重视，特别是在畜牧业发达国家，是不可或缺的基础性饲料[2］。青贮发酵的过程极其复杂，受诸多因素的影响，其中，起主导作用并决定青贮饲料优劣、成败的关键因素是原材料本身的WSC 含量和乳酸菌[3］。当青贮原材料中乳酸菌数量较少时，青贮发酵品质差，营养物质损失多，家畜的适口性与利用率降低[4］。针对这一问题，生产实践中常通过添加乳酸菌来弥补优良乳酸菌缺乏或数量不足的问题，只要WSC 含量不是太低，添加乳酸菌一般都有明显的改善效果[5-6］，但对于WSC 含量不足的材料，即使添加乳酸菌，也很难得到优质的青贮饲料[7-8］，如豆科牧草及部分缓冲能高、WSC 含量低的禾本科牧草。因此，大多需同时添加糖类、含糖物质多的副产物或纤维素酶等[9］，但这些需要较高的人力、物力成本。到目前为止，乳酸菌添加剂都是以正常营养成分及含量的培养基筛选出的产酸多、生长快、耐低温、耐高温或分解某些有害物质等的菌株[10-11］，未见针对低营养条件筛选的添加剂。碳源是微生物生长繁殖的第一营养限制因素，若针对低糖条件筛选耐低营养的乳酸菌菌株，不仅能解决原材料含糖量低或乳酸菌数量少导致的发酵品质差等问题，且能有效降低生产成本。对于丰富乳酸菌剂和低成本高效率生产优质青贮饲料具有重要意义。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是热带和亚热带地区重要的豆科牧草，被称为“热带苜蓿”，因热带亚热带地区多雨潮湿很难将其制成干草，因此，青贮是利用柱花草的有效方式[8］。但由于其缓冲能高、WSC 含量低和表面乳酸菌数量少，自然发酵品质较差[8，12］，青贮期间始终存在梭状芽孢杆菌和肠杆菌等不良微生物，从而导致丁酸积累和蛋白降解[13］。虽然晾晒可以改善发酵品质，但pH 仍高于4.5[12］，只有少数乳酸菌接种剂能够成功发酵，有些乳酸菌对其青贮发酵品质没有积极效果[8，14］。苏丹草（Sorghum sudanense）是热带亚热带地区广泛栽培的禾本科一年生牧草，具有高产、病虫害抗性和耐旱性强等特点，被广泛用于动物饲料[15］。但由于其缓冲能高，WSC 含量相对不足，青贮饲料品质也较差[16］。因此，为改善WSC 不足牧草的青贮发酵品质，筛选耐低营养的乳酸菌具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从华南农业大学教学科研试验基地采集燕麦（Avena sativa）、小麦（Triticum aestivum）和象草（Pennisetum purpureum）等，低温保存于无菌样品袋，带回实验室用于乳酸菌的分离、筛选和鉴定。青贮原料于2017 年3 月26日种植，采用开花前期的柱花草和抽穗期的苏丹草。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化 无菌条件下称取切短的牧草10 g，加入90 mL 无菌生理盐水，充分混匀后稀释至不同浓度。在MRS 固体培养基（酪蛋白酶消化物10 g·L-1，牛肉膏粉10 g·L-1，酵母膏粉4 g·L-1，柠檬酸三铵2 g·L-1，乙酸钠5 g·L-1，硫酸镁0.2 g·L-1，硫酸锰0.05 g·L-1，磷酸氢二钾2 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，吐温-80 1.08 g·L-1，琼脂15 g·L-1）上37 ℃厌氧培养48 h，通过菌落形态观察进行挑选与分离。将分离的菌株从液体培养基与固体培养基反复划线培养，获得纯化的单菌株。再对菌株进行革兰氏染色、镜检观察、过氧化氢酶试验，初步认定为乳酸菌[17］。纯化出的乳酸菌菌株于-80 ℃保存备用。

1.2.2 耐低营养乳酸菌的筛选 将分离的乳酸菌与实验室保存的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM1、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCZZ1和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）HT1活化的第2 代菌株分别接种到0.002、0.02、0.2、2 和20 g·L-1葡萄糖含量的MRS 液体培养基中，接种量为105cfu，培养48 h 后测定OD600进行初筛。初筛的菌株再分别接种到用HCl 调配的pH 为4.0 和4.5 的MRS 液体培养基中复筛，选出既耐低营养又耐酸的乳酸菌菌株。

1.2.3 耐低营养乳酸菌的鉴定 将培养后的筛选菌株接种到不同pH（3.5、4.0、4.5 和7.5）和不同NaCl（3.0%、6.5%和10.0%）浓度的MRS 液体培养基中37 ℃厌氧培养3 d，同时接种到正常培养基中置于10、15、45和50 ℃培养3 d 后，测定OD600。采用API 50 CHL 发酵试剂盒（Bio Mérieux，法国）测定碳源发酵模式。收集筛选菌株菌体，参照细菌DNA 提取试剂盒说明提取DNA，然后进行16S rDNA 扩增，引物序列为：27f（5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492r（5′-TACCTTGTTACGACT-3′），扩增产物送至派森诺生物科技有限公司测序。测序结果用BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）比对，将相似性最高的菌种初步认定为待测菌株的属种。然后从Gen Bank 数据库下载已知菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 进行序列比对，再用MEGA 5.0 的Neighbor-joining 法[18］构建系统发育树。

1.2.4 青贮饲料的调制 用铡草机将收获后的柱花草和苏丹草切割至1~2 cm 的长度，混合均匀后分别添加乳酸菌菌株SCLN1、LM1、HT1、SCLN1+LM1、LM1+HT1和添加等量的无菌水（CK），共6 个处理。菌的添加量基于鲜物质（fresh matter，FM），为105cfu·g-1，水的添加量为1% FM，将处理后的材料混合均匀，取约200 g 装至20 cm×30 cm 的聚乙烯塑料袋中，用真空封口机抽真空密封保存，每个处理4 个重复。60 d 后开袋取样，检测青贮饲料的发酵品质和微生物数量。

1.3 试验指标测定

1.3.1 牧草青贮前化学成分的测定 称取20 g 材料，加入80 mL 蒸馏水完全浸没样品，4 ℃冰箱中放置24 h，过滤得到浸提液，采用pH 计（Mettler Toledo FE28，瑞士）测定pH；采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定缓冲能[2］。称取约150 g 材料，65 ℃烘干至恒重测定干物质（dry matter，DM）含量；粉碎烘干后的样品过1.0 mm 筛，用于测定营养成分，采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量[19］；使用范氏（Van Soest）滤袋分析法（ANKOM A200i，中国）测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量[20］；采用硫酸蒽酮法测定WSC 含量[21］。

1.3.2 牧草青贮前后微生物的测定 无菌条件下称取20 g 样品，加入90 mL 无菌生理盐水，充分混匀后稀释至不同浓度，分别采用MRS 琼脂培养基、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）（蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏粉3 g·L-1，氯化钠5 g·L-1，琼脂15 g·L-1）和孟加拉红培养基（rose bengal agar，RBA）（蛋白胨5 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，磷酸二氢钾1 g·L-1，硫酸镁0.5 g·L-1，琼脂15 g·L-1，孟加拉红0.033 g·L-1，氯霉素0.1 g·L-1）进行乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌和霉菌划板培养后计数。37 ℃厌氧培养乳酸菌1~2 d；30 ℃有氧培养好氧性细菌、酵母菌和霉菌2~3 d。

1.3.3 牧草青贮后发酵品质的测定 青贮开封后，用1.3.1 中的方法过滤出滤液，测定pH、氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）和有机酸含量；采用比色法测定NH3-N 含量[22］；采用岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本）分析有机酸含量。色谱条件：色谱柱为Eleven Organic Acids on Transgenomic COREGel 87H3；检测器：RID-10A；流动相：0.1 mmol·L-1的磷酸溶液；流速：1 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

1.3.4 青贮饲料发酵品质评定 采用V-score 评分[23］对柱花草和苏丹草青贮饲料进行发酵品质的评定。

1.4 数据统计

采用Excel 2019 初步整理试验数据，结合SPSS 20.0 对不同菌株测定的指标进行单因子ANOVA 分析，筛选出耐低营养的乳酸菌菌株。再通过单因子方差分析和Duncan 法比较耐低营养菌株对柱花草和苏丹草青贮发酵品质的影响，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选

通过对分离菌株进行革兰氏染色、镜检观察和过氧化氢酶试验，得到91 株乳酸菌，加上实验室保存的3 株，共94 株菌株。根据其在0.002 g·L-1糖含量的MRS 中的生长情况，初筛得出10 株较耐低营养乳酸菌菌株（表1），其中，菌株SCLN1、LA1和HT1表现显著优于其他菌株。耐酸性试验复筛结果（图1）表明，菌株SCLN1、LM1和HT1均有很强的耐酸性，而菌株LA1的OD 值显著低于除LA4外的其他菌株。耐低营养的耐酸菌株SCLN1和HT1，以及耐低营养稍差的耐酸菌株LM1用于随后的青贮发酵研究。

表1 乳酸菌在不同葡萄糖含量培养基中培养48 h 的OD600值Table 1 OD600 values of lactic acid bacteria cultured in medium with different glucose concentration for 48 h

2.2 耐低营养乳酸菌的生理生化特性与鉴定

菌株SCLN1为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌，发酵类型为同型发酵，能在10~50 ℃和pH 3.5~8.0条件下生长，其温度和酸碱度的生育范围广；6.5%NaCl 条件下微弱生长，具有良好的耐盐性；可利用的糖达23 种（表2 和表3）。

表2 菌株SCLN1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of strain SCLN1

表3 菌株SCLN1可利用的糖Table 3 Available sugars of strain SCLN1

菌株SCLN1与植物乳杆菌MLG5-17 处于同一族群，进化亲缘度100%，与已知菌株序列的相似性为100%（图2）。因此，菌株SCLN1被鉴定为植物乳杆菌。

图2 筛选菌株SCLN1的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of screened strain SCLN1

2.3 柱花草和苏丹草青贮前的特性

柱花草和苏丹草青贮前的DM 含量均超过30%，柱花草粗蛋白含量约为苏丹草的2 倍，NDF 和ADF含量均高于苏丹草。两种牧草的缓冲能都极高，WSC 含量较低，苏丹草（9.26% DM）的WSC 含量高于柱花草（4.74% DM），两种牧草表面乳酸菌数量均较少，低于103cfu·g-1FM，且好氧细菌和酵母数量较多（表4）。

表4 柱花草和苏丹草青贮前的化学特性和微生物数量Table 4 The chemical characteristic and microbial population of stylo and sudan grass prior to ensiling

2.4 柱花草和苏丹草青贮发酵品质

柱花草和苏丹草自然青贮60 d 后的发酵品质较差，pH 均超过5.1，乳酸含量不高于2.00% DM，产生了较多的乙酸（4.82% DM 和2.09% DM）和丁酸（3.64% DM 和3.38% DM），NH3-N 含量分别高达30.50% TN 和29.01% TN（表5）。加菌显著降低了两种牧草青贮料的pH（除LM1+HT1）和NH3-N 含量（除LM1+HT1）（P<0.05），增加了乳酸含量（除HT1和LM1+HT1）。其中，添加SCLN1效果最显著，将柱花草青贮料的pH 由对照的5.36 降至4.67，乳酸含量由2.00% DM 增 加 至4.16% DM，NH3-N 含 量 由30.50% TN 降至11.24% TN；另外，添加SCLN1的苏丹草青贮料的pH（4.10）显著低于CK（5.19），乳酸含量由1.82% DM 增加至8.29% DM，NH3-N 含量由29.01% TN 降至12.69% TN。添加SCLN1均不同程度地降低了两种牧草青贮料的乙酸、丙酸（除苏丹草）和丁酸含量，显著提高了V-score 评分（图3）。混合添加SCLN1和LM1的效果劣于单独添加SCLN1，但在柱花草中优于LM1和HT1的单独添加，在苏丹草中与LM1和HT1的单独添加无显著差异（P>0.05）。混合添加LM1和HT1的效果比单独添加LM1和HT1的效果差。加菌对两种牧草青贮后的微生物（除柱花草的酵母）数量影响不显著（P>0.05）。

图3 添加耐低营养乳酸菌青贮柱花草和苏丹草的发酵品质评分Fig. 3 Fermentation quality scores of stylo and sudan grass silage inoculated low-nutrient-tolerant lactic acid bacteria

表5 添加耐低营养乳酸菌对柱花草和苏丹草青贮发酵品质的比较Table 5 Comparison of the fermentation quality of stylo and sudan grass silage inoculated low-nutrient-tolerant lactic acid bacteria

3 讨论

3.1 乳酸菌的筛选与鉴定

植物叶片表面碳源是乳酸菌定殖的主要决定因素[24］，其含量较低，如Mercier 等[25］曾报道大豆（Glycine max）叶表面总糖和葡萄糖浓度仅有2.5 μg·g-1FM 和1.4 μg·g-1FM。因此，本研究从新鲜牧草表面分离耐低营养乳酸菌，筛选的菌株SCLN1经分子同源分析被鉴定为植物乳杆菌。Kuppusamy 等[26］也曾报道植物乳杆菌能在糖浓度低的培养基中较好生长，而本研究中的植物乳杆菌CCZZ1在葡萄糖低浓度条件下无明显优势，原因可能是同种菌的不同菌株之间对碳源种类和浓度利用存在差异[27］。

3.2 柱花草和苏丹草青贮前的化学特性

本 研 究 中 柱 花 草 的 粗 蛋 白 含 量 较 高，为15.25% DM，高 于Liu 等[12］和Silva 等[28］报 道 的10.41% DM 和12.24% DM，略高于Li 等[29］和Zou 等[30］报道的13.6% DM 和13.3% DM。NDF 和ADF 含量分别与Liu 等[12］与Silva 等[28］报道的结果一致，但ADF 含量略低于Liu 等[12］报道 的47.06% DM，原因可能是原材料的收获期不同[31］。苏丹草的粗蛋白含量比柱花草低，为8.16% DM，与Nazar 等[16］报道的一致。NDF 和ADF 含量也与Nazar等[16］和Stojanovic 等[32］报道的60%~70% DM 和30%~40% DM 一致。一般认为，青贮原材料的干物质含量为30%~35% FM，WSC 含量为6%~8% DM，乳酸菌数量超过5.0 log10cfu·g-1FM，可获得优质的青贮饲料[2］。然而，柱花草和苏丹草的DM 含量虽均达到34% FM，柱花草WSC 含量为4.74% DM，苏丹草的WSC 含量为9.26% DM，但二者的缓冲能极高，分别为569.97 和441.98 mEq·kg-1DM，不利于青贮，这一结果与Nazar 等[16］和Liu 等[12］报道的苏丹草和柱花草的WSC 含量一致。柱花草和苏丹草表面的乳酸菌数量（2.32 和2.75 log10cfu·g-1FM）也较少，好氧细菌和酵母均较多。当乳酸菌在发酵过程中不能产生足够的乳酸来降低pH 并抑制梭状芽孢杆菌的生长时，青贮饲料品质会很差。因此，青贮前有必要添加乳酸菌和糖源物质或耐低营养的乳酸菌控制青贮饲料的发酵。

3.3 柱花草和苏丹草的青贮发酵品质

青贮饲料的pH 是评价青贮发酵品质的重要指标，乳酸是青贮饲料中理想的发酵产物，乙酸主要来源于异型发酵乳酸菌、肠杆菌和丙酸杆菌在WSC 上的代谢物[2］，丁酸和NH3-N 的产生代表牧草中蛋白质的降解和丁酸发酵，蛋白质降解程度会导致牧草的营养物质损失。本研究中，柱花草和苏丹草自然青贮的发酵品质较差，原因可能是两种牧草的WSC 含量低、表面附着的乳酸菌数量少，虽然苏丹草的WSC 含量高于柱花草，但由于其缓冲能高，WSC 含量可能依然不足，因为添加1%葡萄糖显著提高了苏丹草的发酵品质（数据未发表）。

添加耐低营养乳酸菌后，两种牧草的青贮发酵品质均得到改善，尤其是SCLN1。添加菌株SCLN1使柱花草和苏丹草青贮料的pH 分别降至4.67 和4.10，苏丹草青贮料的pH 达到了优质青贮饲料的pH（<4.2），乳酸含量分别增加至4.16% DM 和8.29% DM，丁酸含量降低甚至未检测到，NH3-N 含量也由30% TN 左右降至12%TN 左右，V-score 评分显著提高，表明菌株SCLN1能有效改善柱花草的发酵品质，且改善效果优于Li 等[8］报道的添加植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别将柱花草的pH 由5.32 降至5.10 和5.02 的结果，本研究添加鼠李糖乳杆菌的pH 为5.00，与其一致。Chen 等[33］和Liu 等[34］的研究结果表明添加菌株HT1可显著改善意大利黑麦草（Lolium multiflorum）和紫花苜蓿（Medicago sativa）的发酵品质，本研究中添加菌株HT1虽然也改善了柱花草和苏丹草的发酵品质，但其效果不如菌株SCLN1。此外，本研究中乳酸菌的单独添加效果优于混合添加，这一结果在其他研究中也有报道[35］，原因可能是菌株间竞争底物不同。

4 结论

本研究从分离的91 株乳酸菌和实验室保存的3 株乳酸菌中初筛得到10 株较耐低营养乳酸菌，通过耐酸试验复筛得到两株耐低营养的耐酸菌株SCLN1和HT1、1 株耐酸性强但耐低营养稍差的菌株LM1，HT1和LM1为实验室保存菌株，分别是鼠李糖乳杆菌和肠膜明串珠菌，SCLN1经16S rDNA 和生理生化特性鉴定为植物乳杆菌。将其分别添加到难以青贮的柱花草和苏丹草中青贮后，均显著改善了两种牧草的发酵品质，而单独添加SCLN1的效果显著优于其他菌株单独添加或与SCLN1混合添加。