支气管肺泡灌洗液结核分子生物学检测与外周血T 细胞斑点试验对痰涂片阴性肺结核患者的诊断价值

张 艳 王 华 侯 婧 王 庆

1.安徽省胸科医院结核三科，安徽合肥 230022；2.安徽省胸科医院结核八科，安徽合肥 230022

肺结核（pulmonary tuberculosis，PTB）目前仍是威胁人类健康的世界性公共卫生问题，根据世界卫生组织报告数据显示，2020 年全球新增约987 万例PTB患者，发病率为127/10 万，与2018 年的59.27/10 万及2019年的55.55/10 万比较，仍呈明显上升趋势[1-2]。造成我国PTB 发病率居高的主要原因有以下两点：一方面，PTB 患者早期缺乏典型的临床症状及体征，临床诊断率相对较低、缺乏诊断效能高的诊断方法，延误患者的诊断和治疗；另一方面，作为诊断PTB 金标准的结核分枝杆菌培养需要周期长，难以满足早期PTB 的诊疗需要，从而引起PTB 社区传播的概率增加[3-4]。因此，如何在早期快速确诊PTB 对其防控具有十分重要的意义。因目前临床中痰涂片阴性PTB 患者的早期诊断缺乏病原学依据，仅根据患者症状、体征及胸部CT、结核菌素试验、血结核抗体等进行诊断有局限性。随着实验室检查技术的发展，经气管镜取局部支气管肺泡灌洗液行结核分子生物学检测结合免疫学的T 细胞斑点试验可以在一定程度上提高PTB 的诊断率，因此本研究分析通过支气管肺泡灌洗液结核病（tuberculosis，TB）-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 检测及外周血T 细胞斑点试验在痰涂片阴性PTB 中的临床诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020 年1 月至2021 年4 月在安徽省胸科医院（以下简称“我院”）住院的疑似PTB 患者198例，年龄14～81 岁，平均（40.7±18.4）岁；男137例，女61例。患者有低热、盗汗、乏力、咳嗽、咯血等症状或无明显临床症状，但体检经影像学检查提示有PTB 可能。纳入标准：①胸部CT 和临床症状疑似PTB；②痰涂片阴性；③认知正常，能配合完成相关检查。排除标准：①拒绝支气管镜检查或合并有支气管检查禁忌证；②合并有心脏、肝脏、肾脏等重要脏器严重功能障碍；③人类免疫缺陷病毒感染、免疫功能严重低下等。

1.2 研究方法

以中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断（WS 288—2017）[5]为金标准：①呼吸道分泌物病原学阳性，包括细菌学和分子生物学。②病理学阳性。③免疫学检查阳性。④PTB 可疑症状、体征。⑤影像学检查符合PTB 改变。临床诊断需符合⑤及至少合并有①②③④项中任意一项（其中非病原学与病理学诊断病例需专家会诊确定）。本研究经我院医学伦理委员会审核通过（K2021-018）。对入选患者进行常规检测后行支气管镜检查，根据胸部CT 提示肺部病灶位置取局部支气管肺泡灌洗液，进行TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 检测及外周血T 细胞斑点试验。

1.2.1 TB-DNA 检测设备由迪澳公司提供的核酸扩增荧光检测仪（Deaou-16P），试剂采用广州迪澳生物科技公司的结核分枝杆菌核酸扩增荧光制剂（Deaou-1016）。结果判别：样本检测时Tt≤45 判定为阳性，无Tt 时判定为阴性，Tt 为荧光强度变化函数的二阶导数＞0 且首次出现荧光强度≥阈值，该采集点对应的为阈值时间。

1.2.2 TB-RNA 检测设备采用瑞士生产的罗氏荧光定量PCR 检测仪（LightCycler 480 Ⅱ），试剂由上海仁度生物科技公司提供的结核分枝杆菌核酸扩增荧光制剂（RNA03）。结果判别：Dt≤35 判定为阳性；35＜Dt＜40 的样本建议重新检测；Dt＜40 判定阳性；Dt 无数值或等于40 时结果判为阴性。Dt 为阳性判定值，指样本曲线与阈值交点的横坐标读数。

1.2.3 Xpert MTB/RIF 检测 Xpert MTB/RIF 检测是结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术，检测系统采用美国Cepheid 公司生产的Xpert MTB/RIF 检测仪（16 模块）；试剂是由赛沛公司生产的结核分枝杆菌rpoB 基因突变检测试剂（GXMTB/RIF-CN-50）。支气管肺泡灌洗液样品以2∶1的比例加入样品处理试剂，振摇10～20 次，室温静置15 min，待样本液化完全后，用无菌移液管取出2 ml缓慢加入检测匣中，然后使用检测系统进行检测。约2 h 后仪器自动判读结果高、中、低、非常低及阴性结果。Ct 值与结核分枝杆菌载量的对应关系如下，Ct值＜16 为高；16≤Ct 值＜22 为中；22≤Ct 值≤28 为低；Ct 值＞28 为极低，检测到rpoB 基因突变报告为利福平耐药，未检测到rpoB 基因报告利福平耐药阴性。未检测到结核分枝杆菌目标DNA 为阴性。

1.2.4 外周血T 细胞斑点试验 采用SPOT.TB 酶联免疫荧光斑点分析仪（AID ELISPOT Reader）（德国AID公司），试剂盒（英国Oxford Immunotec Ltd 公司，130100594），严格按照仪器及产品说明书操作。结果判断[6]：①阴性对照孔斑点数＜6 个时，抗原A 孔或抗原B 孔的斑点数-阴性对照孔斑点数≥6 个；②阴性对照孔斑点数≥6 个时，抗原A 孔或抗原B 孔的斑点数≥2×阴性对照孔斑点数。满足以上任意一条为阳性，否则为阴性。

1.2.5 联合诊断 支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测与外周血T 细胞斑点试验联合判定：任意一项阳性判定为阳性，两项均阴性判定为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计数资料采用例数或百分率表示，采用Kappa 系数分析一致性，Kappa 值为＜0.40、0.40～0.75、＞0.75 的情况下分别代表为一致性较差、一般、较好。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同诊断方法与金标准对痰涂片阴性患者PTB诊断的一致性检验

198 例患者中确诊PTB 者153 例，支气管肺泡灌洗液TB-DNA、支气管肺泡灌洗液TB-RNA、支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测、外周血T 细胞斑点试验及支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测联合外周血T细胞斑点试验检查与金标准具有一定的一致性（Kappa=0.512、0.449、0.327、0.373、0.793，P ＜0.001）。见 表1～5。

表1 支气管肺泡灌洗液TB-DNA 与金标准的一致性比较（例）

表2 支气管肺泡灌洗液TB-RNA 法与金标准的一致性比较（例）

表3 支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测与金标准的一致性比较（例）

表4 外周血T 细胞斑点试验诊断与金标准的一致性比较（例）

表5 支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测联合外周血T 细胞斑点试验与金标准的一致性比较（例）

2.2 不同检测方法对痰涂片阴性患者PTB 的临床诊断价值

痰涂片阴性PTB 患者支气管肺泡灌洗液TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 检测及外周血T细胞斑点试验的诊断效能见表6。

表6 不同检测方法对痰涂片阴性患者PTB 的临床诊断价值（%）

3 讨论

在临床就诊的疑似PTB 患者多数痰涂片结果为阴性，由于这部分患者临床表现不一、病情轻重各异，甚至部分患者系体检发现，肺部影像学检查呈多样性而缺乏特异性改变，从而给PTB 快速诊断造成一定难度[7-9]。结核分枝杆菌培养作为诊断TB 的金标准，但该方法一般需4～6 周后才获得检测结果，不利早期诊断[10]。痰涂片检查简单、经济、快速，当天检测结果即可获得，但灵敏度偏低（22%～82%），假阴性报告率为17.6%～78.0%，且不能检出耐药性[11]，这可能导致部分PTB 患者无法在第一时间得到精准治疗，延误病情。但结核病的病原学检查仍是发现PTB传染源的主要检测方法，并为TB 确诊和治疗提供重要依据[12-13]。由于结核分枝杆菌在宿主体内大多处于潜伏感染状态，在这种状态下，结核分枝杆菌可能会在激活前持续潜伏多年，感染和激活之间的时间间隔未知，因此很难追踪感染来源，导致疾病传播情况很难推断[14-15]。近些年来，结核分子生物学及免疫学检查的推广普及可将TB 的诊断从数周的时间降低到数天甚至数小时，临床比较常见的结核分枝杆菌分子生物学及免疫学检查为TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF、T 细胞斑点试验等。

TB-DNA 检测是一种实时荧光聚合酶链反应法检测技术，此方法通过PCR 检测结核分枝杆菌DNA。除活菌DNA 外，即使是死菌DNA 在体内也可以存在很长时间[16-18]，可通过PCR 检测出，故对初治PTB 的敏感性较高，已有曹翌明等[19]研究提示TB-DNA 检测与分枝杆菌培养的结果完全一致。TB-RNA 检测是以结核分枝杆菌RNA 为扩增靶向起点，产物RNA 为检测靶标，由于RNA 只存在于活的结核分枝杆菌中，结核分枝杆菌死亡后菌内RNA 就会很快被降解，故在临床TB-RNA 检测可以用于活动性PTB 的诊断及治疗效果评估。且TB-RNA 方法快速、简单，操作过程中交叉污染少[20]。在本研究中，支气管肺泡灌洗液TB-DNA 与TB-RNA 检测灵敏度较低，可能与样本量较小有关。

Xpert MTB/RIF 检测在本研究中的灵敏度一般，特异度较好，该技术是一种集样本自动制备、DNA 提取、定量PCR 扩增、结核分枝杆菌特异性核酸检测及利福平耐药基因rpo 突变等于一体的快速诊断TB 的方法，同时操作步骤简单，密闭环境检测除可避免实验室人员操作水平及样本结核分枝杆菌菌量少等因素造成的影响外，还可同时检出非结核分枝杆菌的特异度也较高，在一定程度上可提高痰涂片阴性PTB患者的诊断水平[21-23]。此外，刘扬等[24]研究证实，Xpert MTB/RIF 技术应用后TB 的确诊率高于传统的诊断方法，并且可以更早、更好地检测患者是否存在利福平耐药，对PTB 治疗有一定指导作用。

T 细胞斑点试验是运用特异性抗原ESAT-6 及CFP 10，采用酶联免疫斑点技术平台检测患者机体内是否有针对结核分枝杆菌反应的效应T 细胞，由此诊断该患者是否存在结核分枝杆菌感染[25-26]。T 细胞斑点试验不仅灵敏度和特异性较高[27-29]，而且送检时间短，且基本不受机体免疫状况的影响[25]。T 细胞斑点试验除灵敏度较高、标本易获得外，其不受非结核分枝杆菌及其他细菌感染影响，可作为是否有结核感染的鉴别诊断方法，但由于此法不能区分TB 是活动性或潜伏性，临床存在一定的假阴性[25]。本研究结果提示其不能完全替代病原学检测诊断PTB，但本研究中将外周血T 细胞斑点试验与支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测进行联合诊断，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均较好，与金标准的一致性较好，提示联合诊断方法真实有效，具有很好的可靠性。

综上所述，每一项检测方法都具有各自的优势和缺点。其中运用经支气管镜进行局部肺泡灌洗液送检Xpert MTB/RIF 联合外周血T 细胞斑点试验在痰涂片阴性PTB 诊断中具有重要的临床价值。