短链脂肪酸对大鼠脊髓缺血再灌注损伤时小胶质细胞M1/ M2 型极化的影响

王丽萍 李 帆 周坤明 林斯梦

福建医科大学福总临床医学院 厦门大学附属东方医院（厦门大学医学院）福建中医药大学联勤保障部队第九〇〇医院教学基地麻醉科，福建福州 350025

脊髓缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是胸腹主动脉瘤手术的常见并发症[1-3]。脊髓损伤后小胶质细胞因内环境差异可向M1 型或M2 型极化，M1 型表达标志物分化簇（cluster of differentiation，CD）86 及促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β，引起继发性神经损伤，M2 型表达标志物CD206及抗炎因子IL-4，促进神经修复[4-5]。短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）由膳食纤维等不易消化的糖类在结肠被益生菌酵解产生，包括乙酸、丙酸和丁酸等，是肠道益生菌保护中枢神经的重要媒介[6-9]。本研究拟评价SCFA 对大鼠脊髓IRI 时小胶质细胞M1/M2 极化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康雄性SD 大鼠72 只，6～8 周龄，体重200～250 g，购自上海斯莱克实验动物公司[许可证号：SYXK（闽）2018-0006，合格证：20211054]，标准饲料喂养，自由进食水，普通光照，实验操作经联勤保障部队第九〇〇医院动物伦理委员会批准（IEC-2021-52）。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、氯化钠、GLPG0974、伊文思蓝、甲酰胺（美国Sigma 公司，批号：S2889、S1880、S3034、S7653、S2443、E2129、L4264）；CD86 抗体、CD206 抗体、TNF-α 抗体、IL-1β 抗体、IL-4 抗体、磷酸化核因子κB（phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB）p65 抗体、磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）抗体（英国Abcam 公司，批号：ab5076、ab2384、ab6469、ab2055、ab2543、ab2468、ab2398）。主要仪器：酶标仪（美国Bio-Rad 公司，型号：680）；气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司，型号：3100）；正置显微镜（日本Olympus 公司，型号：BX53）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司，型号：MP-3AP）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司，型号：GS800）。

1.3 动物分组

将大鼠按随机数字表法分为假手术组（S 组）、脊髓缺血再灌注损伤组（IRI 组）、短链脂肪酸组（SCFA组）和短链脂肪酸+游离脂肪酸受体2 型（free fatty acids receptor type 2，FFAR2）阻滞剂GLPG0974 组（GLPG组），每组18 只。SCFA 组和GLPG 组的饮水中含有25.9 mmol/L 乙酸钠、40.0 mmol/L 丙酸钠和67.5 mmol/L 丁酸钠，S 组和IRI 组的饮水中含有133.4 mmol/L 氯化钠；饲养4 周后IRI 组、SCFA 组和GLPG 组建立脊髓IRI 模型，S 组实施假手术；GLPG组于再灌注即刻和再灌注第1～6 天时腹腔注射2 mg/kg GLPG0974（生理盐水稀释至1 ml），再灌注期持续供应相应饮水[9-11]。

1.4 建立大鼠脊髓IRI 模型

IRI 组、SCFA 组和GLPG 组经右髂动脉置入2F Fogarty 球囊导管至胸降主动脉起始部，鼓起球囊阻断主动脉时后肢抽动说明脊髓发生缺血，缺血9 min 时恢复灌注[1-3]。S 组除不阻断主动脉，其他步骤相同。

1.5 后肢行为学评分

再灌注1、3、5、7 d 时评定大鼠后肢运动功能、水平绳抓握功能、悬吊能力、45°木棒上的平衡功能及痛行为，功能正常为15 分，完全丧失为0 分[2]。

1.6 血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）通透性测定

再灌注7 d 时每组6 只大鼠测定BSCB 通透性[1]。

1.7 尼氏染色与免疫荧光染色

再灌注7 d 时每组6 只大鼠经心灌流固定脊髓，取L3～5节段石蜡包埋，切片，尼氏染色并计算神经元存活率。切片中滴加羊抗鼠一抗Iba-1（1∶500）和兔抗鼠一抗CD86（1∶600）、CD206（1∶800），避光环境下滴加Alexa Fluor 488 标记的驴抗羊二抗（1∶200）和Alexa Fluor 647 标记的驴抗兔二抗（1∶200），测定红色与绿色重叠的光密度。

1.8 粪便和脑脊液乙酸、丙酸和丁酸浓度测定

再灌注第7 天每组6 只大鼠，收集新鲜粪便密封于顶空瓶，之后麻醉大鼠，从枕骨大孔抽取1 ml 脑脊液密封于另一个顶空瓶，采用气相色谱-质谱联用仪测定粪便和脑脊液乙酸、丙酸和丁酸浓度[12]。

1.9 Western blot 检测

再灌注7 d 时每组6 只大鼠，抽取脑脊液后提取其脊髓总蛋白，加入一抗TNF-α（1∶800）、IL-1β（1 ∶600）、IL-4（1∶800）、p-NF-κB p65（1∶500）、p-STAT3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000），计算各蛋白灰度值。

1.10 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组不同时间点后肢行为学评分比较

整体分析发现：组间比较、时间点比较及交互作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。组内比较：SCFA 组和GLPG 组不同时间点评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较：IRI 组各时间点评分低于S 组，SCFA 组各时间点评分高于IRI 组，GLPG 组各时间点评分低于SCFA 组（P＜0.01）。见表1。

表1 四组不同时间点后肢行为学评分比较（分，）

表1 四组不同时间点后肢行为学评分比较（分，）

注 与S 组同期比较，aP＜0.01；与IRI 组同期比较，bP＜0.01；与SCFA组同期比较，cP＜0.01；与本组再灌注1 d 比较，dP＜0.05。IRI：缺血再灌注损伤；SCFA：短链脂肪酸。

2.2 四组BSCB 通透性、神经元存活率比较

与S 组比较，IRI 组BSCB 通透性升高，神经元存活率减少（P＜0.01）；与IRI 组比较，SCFA 组BSCB 通透性降低，神经元存活率增加（P＜0.01）；与SCFA 组比较，GLPG 组BSCB 通透性升高，神经元存活率减少（P＜0.01）。见图1。

图1 四组BSCB 通透性、神经元存活率比较（n=6）

2.3 粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度比较

IRI 组粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度低于S组（P＜0.01）；SCFA 组粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度高于IRI 组（P＜0.01）；GLPG 组与SCFA 组粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度比较（n=6）

2.4 脊髓小胶质细胞M1 和M2 型标志物

IRI 组CD86 高于S 组（P＜0.01）；SCFA 组CD86低于IRI 组，CD206 高于IRI 组（P＜0.01）；GLPG 组CD86 高于SCFA 组，CD206 低于SCFA 组（P＜0.01）。见图3。

图3 脊髓小胶质细胞M1 和M2 型标志物（n=6，免疫荧光染色，200×）

2.5 脊 髓TNF-α、IL-1β、IL-4、p-NF-κB p65、p-STAT3 水平

IRI 组TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 高于S 组（P＜0.01）；SCFA 组TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 低于IRI 组，IL-4、p-STAT3 高于IRI 组（P ＜0.01）；GLPG 组TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 高 于SCFA组，IL-4、p-STAT3 低于SCFA 组（P＜0.01）。见图4。

图4 脊髓TNF-α、IL-1β、IL-4、p-NF-κB p65 和p-STAT3 水平（n=6）

3 讨论

研究显示，脊髓损伤引起自主神经功能紊乱，导致大便失禁或便秘，肠道益生菌减少，引起粪便SCFA浓度下降[7,13-14]；本研究SCFA 组和GLPG 组于脊髓缺血前4 周及再灌注期持续饮用含有乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠的水，肠道摄入SCFA 进入血液循环，经BSCB内皮细胞的单羧酸转运蛋白-1 及外膜细胞、星形胶质细胞的单羧酸转运蛋白-4 进入脑脊液，20 min 后可在脑脊液检出[6,9-10,15]。本研究结果显示，IRI 组粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度低于S 组；SCFA 组粪便和脑脊液乙酸、丙酸、丁酸浓度高于IRI 组。

FFAR 是G 蛋白偶联受体，被SCFA 剂量依赖性激活，其中FFAR2 分布在小胶质细胞等免疫细胞表面，调节免疫炎症反应[16-18]。研究显示，SCFA 调节NF-κB、STAT3 等信号通路发挥抗炎作用，减轻肺、脑、肝等器官缺血再灌注损伤[19-22]。本研究推测：SCFA激活FFAR2，一方面通过β-抑制素2 信号通路抑制NF-κB p65 磷酸化，下调CD86、TNF-α、IL-1β；另一方面，通过磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信号通路促进STAT3 磷酸化，上调CD206、IL-4，从而减轻脊髓IRI[23-25]。本研究结果显示，与IRI 组比较，SCFA 组后肢行为学评分、神经元存活率升高，BSCB 通透性、CD86、TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 水平降低，CD206、IL-4、p-STAT3 水平升高，FFAR2 阻滞剂GLPG0974可逆转上述指标。

综上所述，SCFA 可促进大鼠脊髓IRI 时小胶质细胞M1 型向M2 型极化，减轻炎症反应。