肠道噬菌体与机体健康的研究进展及临床应用

罗梅娟 张又祥 欧巧群 王丽娜

广州市第一人民医院 华南理工大学附属第二医院儿科，广州 510180

肠道微生物主要由细菌、病毒、真菌和原虫等生物构成，各种微生物间的相互作用和稳态对人体健康十分重要，其中细菌和病毒是肠道微生态系统中含量最为丰富的两种物种［1］。噬菌体又是肠道病毒中的主要成员并且对肠道菌群有重要调节作用。近年来，随着抗生素的广泛应用，全球细菌耐药性明显增加，以肠道微生态为核心的治疗手段更是引起了广泛关注，明确肠道噬菌体构成、发现其功能，既是微生态学研究的关键点，也是人类健康的新切入点。

肠道噬菌体概述

人类消化道中的细菌总量超过1014个，种类1 000～1 150种，在食物分解吸收、抵御外界病原微生物等方面发挥重要作用。健康人的肠道菌群主要由七大菌门组成：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门、梭菌门和螺旋体门，其中前四种菌门的数量占肠道菌群总数的90%以上［2］。噬菌体是肠道病毒组的主要成分，在每毫升粪便滤液中含有高达108亿个病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）［3-4］，根据其裂解能力强弱分为裂解性噬菌体（毒性噬菌体）和溶原性噬菌体（温和噬菌体），根据形态的差异分为有尾噬菌体、无尾噬菌体和丝状噬菌体，进一步分为长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科和短尾噬菌体科等类别。在人体肠道中溶原性噬菌体占主要成分，目前研究认为，在世界范围分布最广的肠道噬菌体是crAss样噬菌体［5］，以不同地区的健康人群作为研究对象鉴定出了核心噬菌体（在＞50%个体中共有的噬菌体）23个和常见噬菌体（在20%～50%个体中共有的噬菌体）132个［6-7］，利用肠道噬菌体组研究可以发现噬菌体和人类健康的关系并探索其在疾病诊疗中的作用［8］。

噬菌体影响机体健康的主要作用机制

1.噬菌体调节肠道菌群构成

（1）捕食。噬菌体能通过识别细菌表面的特定膜受体，选择目标细菌进行“捕食”。肠道噬菌体通过“捕食”作用杀死肠道细菌后会在细菌的基因组上留下特异的CRISPR间隔区序列［9］，通过对这些序列的鉴定发现，人类和动物体内天然噬菌体导致的细菌死亡普遍存在，并在肠道菌群稳定中有重要作用。这种“捕食”多数是特异的，比如普拉梭菌噬菌体可以选择性感染普拉梭菌，并对其他肠道细菌“视而不见”［10］，但对CRISPR间隔区序列的宏基因组学分析也表明，少部分肠道噬菌体在人体肠道中具有广泛的细菌宿主［11］。（2）溶原性转换。温和噬菌体通过改善宿主细菌的状态来弥补自身对宿主细菌的不利影响，从而增强了适应性，并赋予宿主新的表型，这种现象被称为“溶原性转换”。温和噬菌体进入宿主细菌后进行基因整合，进而避免被巨噬细胞识别、清除，并在宿主细菌内长期共存［12］。Taylor等［13］和Wahl等［14］发现溶原性转换可以增加宿主细菌对其他噬菌体的抗性、黏附定植能力、环境的耐受性和抗生素耐药能力。噬菌体的溶原性转换不仅为噬菌体提高了肠道的适应性，也协同宿主细菌提升进化优势。（3）上皮防御。噬菌体可以减少肠道黏液层表面的致病菌定植，并且吞噬、裂解致病菌［15-16］。Barr等［17］的研究发现，在人类肠道中，部分噬菌体会黏附于黏膜上并且减少噬菌体自身的扩散运动，与上皮组织形成类似防御屏障的结构。通过上述几种重要的作用机制，噬菌体能减少外来致病菌的侵袭，增加益生菌的定植能力，调整肠道菌群的结构、维持肠道菌群的平衡，从而增强肠道的屏障功能。

2.肠道噬菌体介导的免疫调节

部分噬菌体能够激活肠道免疫通路，Gogokhia等［18］发现噬菌体可以通过Toll样受体9依赖的干扰素信号通路激活肠道免疫，促进派氏结CD4+和CD8+ T细胞的增殖。有研究也发现，大肠埃希氏菌噬菌体可以发挥免疫抑制作用，抑制肠道免疫细胞扩增，大肠埃希氏菌噬菌体表达的黏附蛋白能够与脂多糖结合，进而控制脂多糖介导的炎性反应［19］。

肠道噬菌体与疾病的关系及临床应用

许多研究表明，健康人群和患者（尤其慢性病患者）的肠道噬菌体组的多样性和结构存在显著差异［20-22］。因此，深入分析肠道噬菌体组可以为揭示各种疾病的病理机制提供新思路，并有利于发现新的诊疗标志物。肠道噬菌体在炎症性肠病、糖尿病、酒精性肝病、结直肠癌、帕金森病等疾病的发生发展中体现重要影响，而噬菌体疗法也在急慢性病原菌感染（如细菌性痢疾、霍乱、难治性艰难梭菌感染、泌尿系感染、烧伤、伤口感染、败血症等）中发挥疗效。

1.炎症性肠病

炎症性肠病是由遗传、免疫、微生物和环境等多因素相互作用引发的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，长期反复的消化系统症状和其他系统功能紊乱给患者带来了沉重的负担。研究证实，炎症性肠病患者与其家庭中的健康成员的肠道病毒多样性和结构存在显著差异，并且与炎症性肠病的进展程度相关［6，23］。普拉梭菌在炎症性肠病患者肠道内相对丰度减少是炎症性肠病的重要菌群特征，进一步分析发现，噬菌体的丰度与普拉梭菌的丰度有关并推测炎症性肠病患者肠内普拉梭菌的死亡率增加系普拉梭菌噬菌体所介导［10］。Zuo等［24］通过宏基因组分析国内溃疡性结肠炎患者的样本发现，肠道有尾噬菌体显著增加，并伴随着大肠埃希氏菌噬菌体和肠杆菌噬菌体丰度显著增加。Yang等［25］的研究认为，健康人群肠道的噬菌体可以通过产生Toll样受体3和Toll样受体7介导的干扰素β，从而抑制肠道炎症发生。Van belleghem等［26］也观察到噬菌体可直接与先天免疫细胞相互作用，在体外孵育外周血单核细胞时，金黄色葡萄球菌噬菌体或铜绿假单胞菌噬菌体可诱导单核细胞的转录反应，并显著提高白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的转录。

2.结直肠癌

结直肠癌是发病率和病死率极高的恶性肿瘤之一，早期无明显症状，多数患者确诊时已为中晚期，多项研究报道了结肠癌患者的病毒组紊乱与结直肠癌发生发展相关［27-28］。与健康人群相比，结直肠癌患者肠道噬菌体群落的多样性显著增加，并且发现肠道病毒组的失调与结直肠癌的进程有关，有20种以上的病毒属在结直肠癌患者和健康人群之间有显著差异［29］。Hannigan等［30］在结直肠癌患者粪便样本中鉴定出组成发生显著改变的病毒，主要是来自长尾噬菌体科和肌尾噬菌体科的噬菌体。Zheng等［31］发现，结直肠癌患者粪便中具核梭杆菌增多，而丁酸梭菌等产丁酸菌减少，具核梭杆菌富集于肿瘤处并且能经Toll样受体4-髓样分化因子88通路诱导结直肠癌细胞自噬来抵抗化疗，而丁酸梭菌分泌的丁酸可抑制结直肠癌细胞，进一步从唾液中分离出具核梭杆菌噬菌体，与装载了结直肠癌化疗药物的纳米颗粒相连，利用动物实验发现这种药物在APCmin/+小鼠的结直肠肿瘤处富集，显著延长结直肠癌小鼠生存期和减少肠道腺瘤发生，并减少具核梭杆菌的丰度，增加丁酸梭菌和结肠丁酸水平。

3.糖尿病

糖尿病是一组以慢性高血糖为主要特征的临床综合征。糖尿病具有并发症多、病情迁延不愈、起病慢以及病程长等特点，会引起肾脏、神经、血管等器官的并发症，影响患者的生活质量的同时也成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。Ma等［32］发现，2型糖尿病患者的肠道噬菌体数量显著高于健康人群，同时发现了7种噬菌体与2型糖尿病的发生发展密切相关。并且2型糖尿病患者肠道噬菌体的改变与宿主细菌的相对丰度和多样性的变化相关。Zhao等［33］对1型糖尿病高危儿童和健康儿童的肠道菌群和病毒基因组进行了分析，发现1型糖尿病高危儿童的病毒组在疾病发生前发生了改变，两组之间的差异随着年龄的增长而增加，其中噬菌体基因组序列与1型糖尿病密切相关，并且发现1型糖尿病患者的血清学指标发生改变前，肠道噬菌体的多样性和相对丰度已经显著降低，而肠道菌群则无显著变化，提示1型糖尿病患者自身免疫性疾病发展过程中肠道菌群的变化可能是由于噬菌体变化引起的［33］。

4.酒精性肝炎

酒精性肝炎是一种与大量摄入酒精相关的疾病，有研究发现，肠道细菌粪肠球菌或许参与了酒精性肝炎的发生［34］。Duan等［35］对酒精性肝炎患者和健康人群的粪便样本进行分析，酒精性肝炎患者粪便样本中粪肠球菌的水平是健康人的300倍，其中大约有80%的酒精性肝炎患者的粪便样本中都发现了粪肠球菌的相对丰度显著增加，进一步分析发现大约30%的粪肠球菌都存在一种能编码细胞溶素的基因。利用高酒精饮食建立酒精性肝炎小鼠模型，通过粪菌移植含有细胞溶素的粪便样本后，这些酒精性肝炎小鼠表现出了一定的肝细胞损伤甚至死亡的现象，而移植了缺失细胞溶素的酒精性肝炎小鼠则并未表现出肝脏损伤的表现，粪肠球菌的噬菌体可以通过靶向减少含有细胞溶素的粪肠球菌，减轻酒精性肝炎小鼠的肝脏损伤程度，从而起保护作用。

5.帕金森病

帕金森病是一种常见的老年神经系统退行性疾病，与遗传、环境、神经系统老化等因素相关。Tetz等［36］分析了32例帕金森病患者和28例健康人的粪便样本。通过对细菌和噬菌体群落组成的比较分析发现，帕金森病患者组中乳杆菌、链球菌和乳球菌显著减少。在健康人中，毒性和温和乳球菌噬菌体的数量大致相同，而在帕金森病患者中，毒性噬菌体占主导地位，其中发现的lytic c2样乳球菌噬菌体和936样乳球菌噬菌体的增加可能对肠道乳球菌具有清除作用，而乳球菌在多巴胺的产生中有重要调节作用。因此，噬菌体介导的乳球菌减少可能加速帕金森病的发展。

6.精神分裂症

精神分裂症是一种机制复杂的精神障碍，近年来随着脑-肠轴研究的深入，越来越多的精神心理疾病发现与肠道微生态相关。Yolken等［37］纳入41例精神分裂症患者及33例健康人，用咽拭子采集DNA样本并进行宏基因组分析。研究发现精神分裂症患者中乳杆菌噬菌体phiadh显著增加。纳入研究的41例精神分裂症患者中，有17例患者的测序结果与乳杆菌噬菌体phiadh有一处或者多处匹配，而健康对照组中只有1例阳性匹配。进一步分析患者的药物使用情况发现，乳杆菌噬菌体phiadh的丰度还与服用丙戊酸钠呈负相关，17例未使用丙戊酸钠的患者，乳杆菌噬菌体phiadh检测呈阳性。

7.临床应用

随着耐药菌的出现，难治性感染性疾病发病率不断增加，利用裂解性噬菌体和纯化的噬菌体裂解蛋白靶向消灭耐药致病菌从而对抗耐药菌感染的治疗手段，再次被重新认识。20世纪初，噬菌体制剂先后在细菌性痢疾、霍乱等治疗中获得成功［38］。1987至1999年间波兰的一所研究所利用噬菌体疗法为1 307例多重耐药菌感染的患者提供治疗，85.9%的患者好转或者伤口愈合［39-40］。难治性艰难梭菌感染作为常见的临床难治性感染性疾病，通过提取健康人粪便中的噬菌体制备粪便滤液作为干预，可以有效治疗该病［41］。Dedrick等［42］报道了1例患有难治性铜绿假单胞菌和脓肿分枝杆菌感染的囊性纤维化患者，通过3种基因改造噬菌体的混合物的6个月治疗后临床症状显著改善。噬菌体疗法也在抗生素耐药相关的泌尿系感染的案例中表现出积极的作用［43-45］，Bao等［45］报道1例63岁女性患者，因广泛耐药肺炎克雷伯杆菌感染继发的复发性尿路感染，通过两轮噬菌体鸡尾酒疗法联合磺胺甲恶唑甲氧苄啶治疗成功治愈。另外一项关于经尿道前列腺切除术后继发的复发性尿路感染的随机对照试验研究发现，噬菌体疗法可以完全清除尿道细菌，极大减少复发可能［46］。Ooi等［47］进行了一项1b期临床研究，用AB-SAO1（3种天然金黄色葡萄球菌噬菌体的混合物）对9例慢性鼻窦炎患者进行鼻内冲洗治疗，结果显示鼻内噬菌体疗法安全、耐受性良好，并且对金黄色葡萄球菌引起的慢性鼻窦炎疗效显著。关于噬菌体裂解蛋白的研究表明［48-49］，噬菌体裂解酶ClyR能选择性杀灭能导致龋齿的细菌和导致根尖周牙髓感染的粪肠球菌，而对常见的口腔共生菌无害，并通过大鼠龋齿模型实验证实能显著降低龋齿程度并具有潜在的治疗牙周病作用。此外，噬菌体疗法也在败血症、术后感染、中耳炎和烧伤中具有治疗作用［50］。

噬菌体疗法的优势与局限

噬菌体疗法的优势：（1）特异性高。一般的抗菌药物相对广谱，清除目标致病菌的同时也引起了其他共生菌群的破坏，长期使用抗菌药物不仅容易引起菌群紊乱，甚至可能导致机会感染，噬菌体能够特异性感染宿主细菌，不影响其他共生菌群。（2）细菌抗性低。研究认为抗菌药物导致的耐药发生率为10万分之一，而细菌对噬菌体发生耐药的发生率为1 000万分之一，且噬菌体可以与细菌“共同进化”从而减少耐药的发生［51］。（3）溶菌能力强。噬菌体可以通过分泌水解酶和多糖解聚酶等酶类破坏细菌的生物膜结构，而抗菌药物对细菌生物膜的作用有限［52］。（4）增殖周期短。噬菌体作为天然的抗菌物质，能够自我复制且增殖周期短，研发周期比一般抗菌药物更短。

噬菌体疗法的局限：（1）抗菌谱窄。由于噬菌体对宿主细菌特异性识别，在多重感染的治疗中其疗效会显著降低，因此，通常需要使用包含多种噬菌体的“鸡尾酒疗法”，这也造成了生产成本的增加［53］。（2）细菌CRISPR系统的抵御。细菌的CRISPR系统可以裂解噬菌体和DNA从而抵御噬菌体，目前还没有有效的方法避免该抵御系统［54］。（3）潜在风险。尽管噬菌体疗法的安全性被许多研究证实，但仍存在毒性或抗性基因转移到受感染细菌中的潜在可能，从而导致高致病性菌株出现的风险［55］。

总 结

日益严重的抗生素耐药问题使得噬菌体重回临床医生和研究人员的视野，近年来关于噬菌体疗法的研究也日渐增多。噬菌体所具备的宿主特异性高、抗性低等优点无疑为解决细菌耐药的困局提供了重要的突破方向，但噬菌体也存在潜在毒性风险、抗菌谱窄等局限，而目前的研究尚集中在临床个案和动物实验，在这些研究中，噬菌体疗法尽管体现了良好的有效性和安全性，但在正式投入临床应用前还需要克服许多难题。相信随着噬菌体作用机制的不断被阐明，噬菌体疗法将不断被完善和应用。