基于2T2D相关谱技术分析玉米自交系亲缘关系

刘 洋, 杨仁杰, 刘海学

(天津农学院, 天津 300392)

我国是粮食生产大国,种业是国家战略性、基础性的核心产业,是促进农业长期稳定发展、保障国家粮食安全的根本。玉米是我国重要的粮食和饲料作物之一,2012年已经成为我国产量第一的粮食作物[1]。玉米产量提高主要依靠新品种的选育与推广,而优良自交系的选育是玉米利用杂种优势的前提,种质资源是玉米育种工作者进行玉米新品种选育的基础[2]。20世纪80年代后期,随着生活水平的提高,对农作物品质的要求越来越高,加强品质育种成为当前农作物研究的主要内容[3]。目前的玉米育种多采用系谱法来选择优良世代和杂交优势强的父母本,耗时长,且极易受到环境条件的影响。由于传统育种方法选择不定向,导致收集种子等的工程量浩大,浪费人力物力资源[4]。因此,发展一种能够大批量、实时、快速且能在早期鉴别出玉米自交系亲缘关系用于玉米育种的分析方法非常必要。

光谱分析技术是一种高效、快速的现代分析技术,它综合运用了计算机、光谱学和化学计量学等多个学科的最新研究成果,并以其非破坏性、无需样品预处理、速度快、成本低等特点在农业中被广泛应用[5-10]。美国Du Pont公司利用近红外光谱技术进行油用玉米品种的筛选,Dyer指出:“利用近红外单粒分析,可以在育种周期中节省一个世代”[11]。2T2D(Two-trace two-dimensional)相关谱是在广义二维相关谱基础上发展起来的两谱相关谱技术,该技术将实验设计和数据处理相结合,可有效提取复杂生物体系中微弱变化的特征信息,特别适合相似样品的判别分析[12-18]。目前,未见基于2T2D相关谱技术来分析玉米自交系亲缘关系的相关报道。本研究借助近红外、中红外光谱仪,通过对不同玉米自交系的近/中红外光谱、同谱2T2D近/中红外相关谱和异谱2T2D近-中红外相关谱进行分析,以期为玉米自交系亲缘关系的鉴别及分类提供一种新的视角。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用材料为本实验室保存的3个玉米自交系,分别命名为样品1、样品2、样品3。取等量玉米样品粉碎、过80目筛,装袋,备测。

1.2 实验仪器

美国PerkinElmer公司的Spectrum GX傅里叶变换近红外光谱仪和中红外光谱仪。近红外采用积分球附件,扫描范围4 000～9 000 cm-1,分辨率4 cm-1;中红外采用衰减全反射(ATR)附件,扫描范围650～3 000 cm-1,分辨率4 cm-1。采用高速万能粉碎机(FW100)对样品进行粉碎。

1.3 实验方法

近红外光谱扫描:首先将准备好的待测样品盛于直径10 mm的指形样品杯中,并压实,接着将样品杯放入旋转样品台进行近红外漫反射光谱测试。

中红外光谱扫描:将准备好的待测样品盛于ATR晶体ZnSe表面,并通过压板压实,使其紧贴在晶体表面,然后进行中红外衰减全反射光谱测试。

1.4 分析方法

所采集的3个玉米自交系的近红外光谱和中红外光谱,根据研究目标选择样品光谱,形成近红外光谱矩阵A和中红外光谱矩阵B:

其中,Si(v)和Sj(v)分别是第i和j个样品的近红外或中红外光谱,i=1,2,3;j=1,2,3;i≠j。

根据Noda[12]理论,第i和j个样品在波数为v1和v2处异谱2T2D近-中红外相关谱Ф(v1,v2)可通过公式计算获得:

式中,k为相关分析的光谱数,本研究中k=2,T表示转置。

如果B=A,根据公式可得第i和j个样品的同谱2T2D近红外相关谱;若A=B,即可得第i和j个样品的同谱2T2D中红外相关谱。

2T2D相关谱技术可以提供两个不同样本(一个参考样本,另一个为待分析样本)来源吸收峰之间丰富的、有价值的相关信息,对待分析样本与参考样本之间的差异信息具有高的灵敏度[12-14]。本研究主要利用该技术来提取并分析两个不同玉米自交系之间的差异光谱信息,实现其亲缘关系的鉴别。

采用Origin2018软件完成一维光谱图绘制,课题组编写的二维相关MATLAB代码实现2T2D相关谱和自相关谱的计算及图谱绘制。

2 结果与分析

2.1 不同玉米自交系的近红外光谱

图1 3种玉米自交系的近红外漫反射光谱Fig.1 Near-infrared diffuse reflectance spectra of three maize inbred lines

2.2 不同玉米自交系的中红外光谱

图2为3种玉米自交系在650～3 000 cm-1范围的中红外衰减全反射光谱。由图2可知,在848 cm-1、1 008 cm-1、1 144 cm-1、1 344 cm-1、1 644 cm-1、1 744 cm-1、2 852 cm-1和2 924 cm-1处均存在特征峰,特征峰对应的主要化学成分是烃类化合物、酚类、醇类、醚类、芳香族类和脂肪酸等。与近红外光谱相比,3种玉米自交系在中红外波段吸光度存在较大差异。

图2 3种玉米自交系的中红外衰减全反射光谱Fig.2 Mid-infrared attenuated total reflectance spectra of three maize inbred lines

2.3 不同玉米自交系间2T2D近红外相关谱

相对于常规的一维光谱,2T2D相关谱技术具有高的光谱分辨率,可提供研究体系随外扰变化的光谱信息。本实验以不同玉米自交系为外扰,对其进行2T2D相关谱计算,根据相关峰强度实现两个玉米自交系亲缘关系的判别。两个样品越相似,其相关强度越小,如果两个样品完全相同,理论上其在任何波数处相关强度应为0;反之,两个样品差异性越大,其相关强度越大。

图3～图5分别是3个样品之间的2T2D近红外相关谱和对应的自相关谱。样品1与样品2相关强度的范围为0～4.2×10-4,样品1与样品3相关强度范围为-2.0×10-5～1.8×10-5,样品2与样品3相关强度范围为0～5.5×10-4。根据相关强度可推断,样品1与样品3较相似,亲缘关系较近;样品1与样品2、样品3与样品2存在差异,亲缘关系较远。

图3 样品1与样品2的2T2D近红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.3 2T2D near infrared (NIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

图4 样品1与样品3的2T2D近红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.4 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

图5 样品2与样品3的2T2D近红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.5 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.4 不同玉米自交系间2T2D中红外相关谱

图6～图8分别是3个样品之间的2T2D中红外相关谱和对应的自相关谱。可观察到,样品1与样品2的相关强度比样品1与样品3的相关强度高1个数量级;样品2与样品3的相关强度比样品2与样品1的相关强度高1个数量级;样品3与样品2的相关强度比样品3与样品1的相关强度高2个数量级。从上述分析可推断,样品1和样品3较相似,亲缘关系较近;样品2与样品3存在较大差异,亲缘关系较远。

图6 样品1与样品2的2T2D中红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.6 2T2D mid-infrared (MIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

图7 样品1与样品3的2T2D中红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.7 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

图8 样品2与样品3的2T2D中红外相关谱(A)和自相关谱(B)Fig.8 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.5 不同玉米自交系间异谱2T2D近-中红外相关谱

为进一步说明方法的有效性,对3个玉米样品进行异谱2T2D近-中红外相关分析(图9～图11),相关强度的关系为:样品2与样品3>样品1与样品2>样品1与样品3。证明样品1与样品3为相近的玉米自交系,亲缘关系较近;样品2和样品3存在较大差异,亲缘关系较远。

图9 样品1与样品2的异谱2T2D近-中红外相关谱Fig.9 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 2

图10 样品1与样品3的异谱2T2D近-中红外相关谱Fig.10 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 3

图11 样品2与样品3的异谱2T2D近-中红外相关谱Fig.11 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 2 and sample 3

3 结论与展望

本研究从近/中红外光谱、同谱2T2D近/中红外相关谱以及异谱2T2D近-中红外相关谱入手,对玉米自交系亲缘关系进行初步分析。结果表明,近红外光谱3个样品光谱轮廓相似,仅在吸光度存在差异,而中红外光谱与近红外光谱相比,3个玉米自交系在中红外波段吸光度存在较大差异。从样品之间的同谱和异谱2T2D相关强度都可以推断,玉米自交系样品1与样品3较相似,亲缘关系较近;样品2与样品3存在较大差异,亲缘关系较远。研究结果表明,基于2T2D相关谱技术来确定玉米自交系的亲缘关系是可行的,该技术可能成为种子快速可靠的预筛选方法。

下一步继续将2T2D相关谱技术与统计学、化学计量学相结合,提取与种子参数相关的特征光谱信息,实现对其他玉米自交系的亲缘关系进一步鉴别,并补充和完善上述鉴别方法,以进一步验证所建立方法的可行性和准确性。同时,该方法也可推广应用到其他作物上,如小麦、水稻、大豆等,为其他作物的育种提供参考方式。