15个油用紫斑牡丹品种核型及亲缘关系分析

段英姿, 客绍英, 王晓英, 张胜珍, 马艳芝

(1.唐山师范学院生命科学系, 河北 唐山 063000; 2.河北农业大学, 河北 保定 071000)

油牡丹属于芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan),也称油用牡丹、食用牡丹、药用牡丹,是一种新兴的木本油料作物。牡丹籽可榨油,根可入药,花可观赏,属我国特有资源植物。2011年国家批准牡丹籽油为新资源食品[1]。目前油牡丹的研究主要集中在引种[2-3]、栽培[4-5]、营养物质[6-7]、成分分析[8-10]、牡丹籽油提取及品质[11-13]、理化性质[14-15]、产业发展[16-17]等方面。我国种植且有良好表现的油用牡丹主要是凤丹牡丹(Paeoniaostill)和紫斑牡丹(Paeoniarockii)两大类[18],其品种繁多,种源混杂,呈现遗传多样性状态。如河南紫斑牡丹[19]和甘肃紫斑牡丹[20]虽都称紫斑牡丹,但核型不同。为丰富油用牡丹优良资源及开发利用,可系统分析不同品种油牡丹的遗传学背景。

核型分析是细胞水平研究植物亲缘关系的有效方法之一,与核型似近系数聚类分析[21]结合已广泛应用植物[22-23]亲缘关系及进化程度的研究,关于油牡丹及与其他牡丹亲缘进化关系的核型研究已有报道[24-26]。但是未见多种油牡丹品种核型比较及核型似近系数聚类分析的相关报道。本研究以引自甘肃兰州产油高、市场份额大、表现好的15个不同花色紫斑牡丹为材料,采用常规根尖压片法分析其核型,并在核型不对称性程度分析上初步比较了两种核型不对称系数As.K[27]和AI[28]结果,作CVCL-CVCI散点图和核型似近系数聚类分析,综合分析不同紫斑牡丹的核型特征、进化程度及亲缘关系,为油牡丹的资源利用,并了解其花型花色遗传规律及品种选育等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

15个紫斑牡丹材料均来自甘肃兰州甘肃花多多农业科技有限公司,详见表1。

表1 试验材料Table 1 Experimental materials

1.2 方 法

1.2.1染色制片

将15个紫斑牡丹品种栽于盆中,待长出新根后,取根尖1～2 cm参照段英姿和马艳芝[22]的方法制片,1 mol/L HCl溶液室温条件下解离17 min,切取分生区部分于载玻片上用改良的苯酚品红染液染色1～2 min,压片后于Nikon E100显微系统镜检,拍照。

1.2.2核型分析

染色体数目的确定、核型应分析的细胞数目和核型标准参照李懋学和陈瑞阳[29]的方法,用Photoshop CS6软件测量染色体长度,并配对。参照Stebbins[30]的方法进行核型分类,参照乔永刚和宋芸[31]的方法绘制模式图,核型不对称系数As.K参照Arano[27]的方法计算,核型不对称系数AI参照Paszko[28]的方法计算,并作CVCL-CVCI散点图。

1.2.3核型似近系数聚类分析

参照吴昌谋[32]的方法计算核型似近系数及遗传距离,并进行核型似近系数聚类分析[33]。

2 结果与分析

2.1 不同油用紫斑牡丹品种的核型比较

15个紫斑牡丹品种的染色体图、核型及模式图见图1,染色体各参数见表2和表3。由图1可知,15种紫斑牡丹的染色体数目相同,均为2n=10条,染色体基数x=5,属二倍体物种。

表2 15个紫斑牡丹品种的染色体参数Table 2 Chromosomes parameters of 15 varieties of Paeonia rockii

表3 15个紫斑牡丹品种染色体的核型Table 3 The karyotype of 15 varieties of Paeonia rockii

15个紫斑牡丹品种的染色体相对长度在15.39%～25.33%之间,其中“燕尾白”的变化范围最大,其次是“紫莲灯”和“蓝鹤齐鸣”,“玉瓣绣球”的变化范围最小,其次是“红莲”“玫瑰撒金”和“墨冠玉珠”。

15个紫斑牡丹品种的染色体长度比均小于2,在1.38～1.65之间,种间差异不大。其中“玉瓣绣球”的染色体长度差异最小,其次是“玫瑰撒金”和“红莲”,“燕尾白”的染色体长度差异最大。

根据相对长度系数可知,15个紫斑牡丹品种皆由中长(M2)和中短(M1)染色体组成,“粉西施”“矮红绣球”和“红莲”染色体长短组成相同,且M2多于M1,其他品种染色体长短组成相同,均为M1多于M2。

15个紫斑牡丹品种的染色体类型为中部(m)、近端部(sm)或近中着丝粒染色体(st),且m型数量多于sm型和st型。“红莲”由m型和st型染色体组成,核型公式为2n=2x=8m+2st。其他14种紫斑牡丹皆由m、sm和st三种类型染色体组成,核型公式均为2n=2x=6m+2sm+2st。

图1 15个紫斑牡丹品种的染色体图片、核型图及核型模式图 Fig.1 Chromosome picture,karyotypes and idlograms of 15 varieties of Paeonia rockii

由图1可知,15个紫斑牡丹品种都有随体,不过随体的数量和位置有差异。每个品种的第4对和第5对染色体均有随体,有的在第1对上,有的在第2对上,有的第1对和第2对均有。每种紫斑牡丹的细胞中,两条同源染色体并不是都有随体,一般是其中一条有随体,且不同细胞随体的数量有所差异,结果见表3。

15个紫斑牡丹品种的着丝点指数在0.16～0.47之间,种间差异不明显,平均指数0.37～0.39。臂比在1.15～5.18之间,其中“夜光杯”臂比差异最大,“灰鹤”差异最小,平均臂比在1.90～2.18之间,差异不大。15个品种的臂比超过2的百分比均为20%,核型均属于2A型。

2.2 不同油用紫斑牡丹的核型进化程度分析

核型进化程度由核型不对称系数来衡量[27]。15个紫斑牡丹品种的核型不对称系数As.K在60.21%～62.13%之间,差异较小,比较接近50%,且核型均属于2A型,核型对称程度较高,说明15个紫斑牡丹品种进化程度均较为原始。“矮红绣球”和“玫瑰撒金”的核型不对称系数As.K最大,均为62.13%,是进化程度最高的,“红莲”的最小,最原始。进化程度为:“矮红绣球”=“玫瑰撒金”>“夜光杯”>“燕尾白”>“玉瓣绣球”>“粉西施”>“世纪巨星”>“北极光”>“灰鹤”>“墨冠玉珠”>“紫云峰”>“紫莲灯”>“蓝鹤齐鸣”>“紫楼藏玉”>“红莲”。

Paszko[28]认为,新的核型不对称系数AI能更准确地反映核型的不对称性程度。由表3可知,15个紫斑牡丹品种的核型不对称系数AI在3.86～5.81之间,变异幅度与核型不对称系数As.K相近。“燕尾白”的核型不对称系数AI最大,“红莲”的核型不对称系数AI最小。依据核型不对称系数AI,进化程度由高到低依次为:“燕尾白”“夜光杯”“紫莲灯”“蓝鹤齐鸣”“粉西施”“紫云峰”“北极光”“世纪巨星”“玉瓣绣球”“墨冠玉珠”“矮红绣球”“紫楼藏玉”“玫瑰撒金”“灰鹤”“红莲”。

2.3 不同油用紫斑牡丹品种的亲缘关系分析

2.3.1CVCL-CVCI散点图

近缘类群之间的亲缘关系也可由CVCL-CVCI散点图[28]分析,万娟等[34]、刘红昌等[35]用此方法作了相关研究。由图2可知,15种紫斑牡丹分布在4个区域,“蓝鹤齐鸣”“紫云峰”“世纪巨星”“紫莲灯”“北极光”“粉西施”“夜光杯”7个品种离得最近,集中在一个区域;“矮红绣球”“玉瓣绣球”“红莲”“墨冠玉珠”“玫瑰撒金”“紫楼藏玉”6个品种离得较近,集中在一个区域;“灰鹤”离“紫楼藏玉”较近,但又独立一隅,“燕尾白”离得最远。从区域分布可初步看出15个紫斑牡丹品种亲缘关系的远近。

图2 CVCL -CVCI散点图 Fig.2 The scatter diagram of CVCL against CVCI

2.3.2不同油用紫斑牡丹品种的核型似近系数和遗传距离及聚类结果

15个紫斑牡丹品种间的似近系数都比较大(表4),在0.93以上。“世纪巨星”和“北极光”之间的核型似近系数最大(0.999),核型进化距离最小(0.011),亲缘关系最近;其次是“粉西施”和“红莲”;“燕尾白”和“红莲”的核型似近系数最小(0.930 6),核型进化距离最大(0.072),亲缘关系最远,其他种间的似近系数差异不大。

表4 15个紫斑牡丹品种的核型似近系数和进化距离Table 4 The karyotype resemblance-near coefficient and evolution distance of 15 varieties of Paeonia rockii

当核型似近系数为0.990 9时,15个紫斑牡丹品种聚为四类:“蓝鹤齐鸣”“紫莲灯”“紫云峰”“世纪巨星”“北极光”“粉西施”和“夜光杯”聚为第Ⅰ类,“灰鹤”和“紫楼藏玉”聚为第Ⅱ类,“矮红绣球”“红莲”“玫瑰撒金”“玉瓣绣球”和“墨冠玉珠”聚为第Ⅲ类,“燕尾白”为第Ⅳ类;当似近系数为0.985 0时聚为三类,此时第Ⅰ类和第Ⅱ类聚为第Ⅴ类,当似近系数为0.975 4时聚为两类,第Ⅴ类与第Ⅲ类聚为第Ⅵ类,“燕尾白”与其他油用牡丹遗传距离最远,还是单独一类(图3)。

图3 15个紫斑牡丹品种的核型似近系数聚类分析 Fig.3 Clustering drawing of 15 varieties of Paeonia rockii by karyotype resemblance-near coefficients

3 讨 论

芍药属染色体基数x=5[26],紫斑牡丹属芍药属牡丹组,15个紫斑牡丹品种虽然花色不同,但均为二倍体,染色体数目相同,2n=10条,这与其他学者对凤丹牡丹[24]、紫斑牡丹[25]、杨山牡丹[36]等的研究结果一致,均为二倍体,染色体数目也是2n=10条。

不考虑随体,文献报道较多的牡丹品种核型主要有两种:2n=2x=6m+2sm+2st,2n=2x=10=8m+2st,如李思峰等[37]的杨山牡丹、王凯琪等[38]的黄牡丹、李子峰等[24]的凤丹白牡丹、张赞平[19]的河南紫斑牡丹属第一种核型,王凯琪等[38]的矮牡丹、于玲等[20]的5种甘肃紫斑牡丹属第二种核型,史倩倩等[39]报道的30个中原牡丹品种核型均属第一种核型,侯小改等[40]报道的14个牡丹品种中有4种属于第一种核型,有8种属于第二种核型。本研究中15个不同花色紫斑牡丹品种的核型亦分为两类,除了“红莲”属第二种核型外,其余14种都属于第一种核型。说明牡丹品种虽繁多,但核型组成相对稳定。本研究中“夜光杯”的核型属于第一种,而于玲等[20]研究的“夜光杯”的核型属于第二种,这可能与同一品种经过多年的种植筛选发生了结构变异有关。

虽然在15个紫斑牡丹品种中都发现了随体,但是随体的数量和位置有差异,随体主要在第1,2,4,5对染色体上,这与史倩倩等[39]研究结果类似。本研究发现,品种内同株根尖不同细胞观察到的随体数量和位置有差异,有的细胞观察不到随体,有的细胞在第5对上有,有的第1对或第4对上有;有的观察到同源染色体中的一条有,有的一对同源染色体都有,体现了随体的不稳定性。可能与制片、观察、判断等有关[36,40-41]。芍药属植物染色体的随体属于微型随体[36],因此在染色体制片操作中如果染色体浓缩过度和施压过重,就观察不到,或者两个微型随体相连也不易被观察到,只有随体较延伸时才易被识别,因此会出现上述随体有无、杂合和纯合的多态现象。在核型分析中,随体是重要的核型特征,具有种的特异性。对于牡丹这种微型随体的有无、杂合和纯合的多态现象,作者认为可作为牡丹的一个细胞学特征,但在确定牡丹的核型时,因为随体的数量和位置往往取决于制片效果,不能准确确定随体的数量和位置,因此是否作为此物种的特异性值得进一步探讨。

15个紫斑牡丹品种的核型均属于较为对称的2A型,核型不对称系数As.K在60.21%～62.13%之间,比较接近50%,进化比较原始。这与王凯琪等[38]、史倩倩等[39]、张赞平和侯小改[36]研究的牡丹品种结果类似,可以看出牡丹的核型进化比较原始。核型不对称系数AI在3.86～5.81之间,数值比较小,也反映了在进化上比较原始,但是核型不对称系数As.K和AI分别分析15个紫斑牡丹品种核型进化程度的结果不同。这可能与两者涉及的参数不同有关,核型不对称系数As.K用到的参数为长臂总长和全组染色体总长,参数比较单一;核型不对称系数AI涉及的参数为染色体长度和着丝点指数,变异系数是由相应标准差和平均值计算而得。目前报道中用核型不对称系数As.K分析核型进化程度的最多,至于两种方法中哪种能更准确地反映核型的不对称性程度,有待进一步证明。

CVCL-CVCI散点图结果在一定程度上反映了15个紫斑牡丹品种的亲缘关系,15个品种分别集中在4个区域,“灰鹤”虽单独一隅但离“矮红绣球”“玉瓣绣球”“红莲”“墨冠玉珠”“玫瑰撒金”“紫楼藏玉”这一区域较近,说明其亲缘关系也较近。这与核型似近系数聚类分析结果有相似之处,当核型似近系数为0.990 9时,15个紫斑牡丹品种聚为4类(图3):除“灰鹤”和“紫楼藏玉”聚为一类外,其他三类聚类结果与散点图结果相同。但当核型似近系数为0.985 0时,15个紫斑牡丹品种聚为3类,此时“灰鹤”“紫楼藏玉”和“蓝鹤齐鸣”和“紫莲灯”“紫云峰”“世纪巨星”“北极光”“粉西施”和“夜光杯”聚为一类,与散点图结果相反。这两种方法都反映了亲缘关系,CVCL-CVCI散点图分析涉及到染色体长度和着丝点指数各参数,核型似近系数聚类分析除染色体长度、着丝点指数各参数外还有臂比等参数,后者分析涉及参数多,分析更全面细致。

4 结 论

15种油牡丹虽都属紫斑牡丹,但核型各参数:染色体相对长度、平均着丝点指数、臂比、平均臂比、染色体长度比、核不对称系数等大小是有差异的;品种间各核型参数大小变化范围相近,核型进化程度均较原始,且核型似近系数比较高,在0.93之上,说明这15种油牡丹亲缘关系比较近;核型进化程度和亲缘关系与花色、花型不存在相关性。