流苏树种子霉变环境条件与致霉菌种类研究

成彦丽，周国林，杨竟然，袁本园，徐晨，王雪娟

1.安徽科技学院建筑学院，安徽 蚌埠 233000 2.安徽水利生态环境建设有限公司，安徽 蚌埠 233000

流苏树(Chionanthusretusus)又名炭栗树、四月雪、晚皮树、铁黄荆、糯米花、茶叶树等，为木樨科流苏树属的一种落叶乔木或灌木，是我国特有的二级保护植物[1-2]。成年流苏树树形高大、枝叶茂盛，花朵像雪一样洁白，花形较为纤细，盛开时像天上的云朵一般，清香四溢，具有良好的观赏效果，在园林绿化中可作行道树、点缀或群植等[3]。流苏树喜光、耐荫、耐旱、耐寒、耐瘠薄，喜湿润肥沃的河沟、沙壤土、碎石山地等，对土壤适应性强。该植物是嫁接桂花的优良砧木，嫁接后的桂花观赏效果与生活力明显优于白蜡、女贞等其他砧木[4-5]。另外，流苏树还具有一定的其他经济价值，如它的嫩叶可以代茶作饮料，其香气不亚于“龙井”；果实含油量大，可榨油供工业用[6]。

尽管流苏树用途广泛，但其种子繁殖却比较困难[2]。流苏种子外壳较为坚硬，果实成熟落地后，在秋季先长出胚根，于第二年春天才能长出胚芽，胚芽和胚根呈现不同步休眠。流苏的种子为“二年种子”。因此流苏种子发芽速度较慢[4-6]。流苏种子在室内常温干燥贮藏和湿沙催芽过程中极易发生霉变现象。有学者认为在大田条件下其发芽需要干燥略微潮湿环境，以保证种子不烂安全度过第二年夏天，如果水分控制不慎，流苏种子极易发霉腐烂，导致发芽率很低甚至不发芽[6]。为此，笔者对流苏种子含水量、吸水率及生活力等进行了检测；同时观测了室温干燥贮藏和室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽种子的霉变环境条件，了解霉变对种子生活力和萌发力的影响，并对导致其霉变的菌种进行初步研究，以期为流苏种子的科学贮藏和正常萌发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

流苏种子于2021年1月购于大博种业；赤霉素购于北京索莱宝科技有限公司；高锰酸钾购于上海新瑞精细化工有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购于上海麦克林生化科技有限公司；乙醇(无水乙醇)购于沪试国药集团化学试剂有限公司；湿沙要求沙子手握成团，无水流出，手松开后沙团有裂缝，一碰即散。

1.2 试验方法

1.2.1 种子质量检测

检测种子净度、千粒重、含水量、生活力、吸水率，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定种子活力[7]。

1.2.2 种子形态测定

随机取50粒流苏种子，用游标卡尺分别测量种子纵和宽，计算平均数与极值。

1.2.3 发霉现象观察

①室温贮藏种子霉变现象：4月上旬，室内常温贮藏种子出现霉变现象。②室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽过程中的霉变现象：2020年1月取流苏种子若干，用25 ℃的自来水浸泡48 h后，将湿沙与种子以3∶1的比例混合，在室温条件下层积；3月上旬取出层积种子，用0、100、200、300、400、500、600 mg/L的赤霉素进行处理，然后继续置于湿沙中室温催芽。自3月底起，不同处理的流苏种子无发芽迹象且开始出现霉变。

1.2.4 发霉环境条件分析

流苏种子发霉现象主要出现在4月上旬，在中国天气网(http：//www.weather.com.cn/)上搜寻4月1日至4月15日试验地的最高气温、最低气温、相对湿度以及降雨时间。用日最高、最低温平均法计算日均温；用某一段时间内逐日平均气温≥10 ℃持续期间日平均气温的总和，即活动温度总和来计算积温。

1.2.5 致霉菌种类鉴定

取室内常温干燥贮藏和室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽的霉变种子为样品提取感染致霉菌的DNA，进行ITS扩增。经过样本检测、PCR、纯化、建库、测序等环节，测序得到原始数据(Raw Data)。对Raw Data进行拼接、过滤，得到有效数据(Clean Data)，进一步降噪，得到ASVs序列。基于ASVs序列在数据库中进行比对分析，得到温室内常温干燥贮藏和室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽种子的致霉菌种类和丰度，并分析这些致霉菌的Alpha多样性。

2 结果与分析

2.1 种子生活力分析

该批种子的千粒重为200.90 g，净度约为93.90%，含水量约为13.35%。通过TTC染色法观察种胚染色情况，发现未发霉的流苏种子种胚被染成红色，即具有成活力的种子45粒，不显色的无生活力的种子5粒，正常流苏种子生活力较高达到81.82%。室内常温干燥贮藏条件下发生霉变的流苏种子具有生活力的种子22粒，无生活力的种子28粒，发霉流苏生种子活力不高，仅有44.00%。

2.2 种子形态分析

采用游标卡尺测量50粒流苏种子的纵和宽，可知流苏种子的纵约为11.70 mm，宽约为4.04 mm。其中纵的最大值达15.35 mm，宽的最大值达到4.97 mm；纵的最小值为7.71 mm，宽的最小值为3.10 mm。

2.3 种子吸水率分析

流苏种子种皮的透水性如图1所示，流苏种子去壳与不去壳的透水性不同，但最终吸水率差别不大。浸泡12 h时去壳与不去壳种子吸水率都接近32.00%，在浸泡12 h前，不去壳种子的含水量高于去壳种子；在浸泡12 h后相反，去壳种子含水量高于不去壳种子。由图1可知，去壳后的种子吸水速率增长较大，并且持续上升，在96 h时达到吸水率最高值84.11%。96 h时不去壳种子吸水率为72.30%。随着浸泡时间的增加，发现流苏出现了霉变现象。试验结果表明，流苏种子去壳和不去壳的对其吸水率影响不大。

图1 流苏种子吸水率Fig.1 The water absorption of C.retusus seeds

2.4 霉变现象观察与分析

解剖室内常温干燥贮藏的霉变不去壳种子，发现种壳内外均出现黑色致霉菌，种皮上附着黑色致霉菌较多且伴有少量白色绒毛状致霉菌，4月上旬霉变率为60.00%。同时花盆里室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽的种子也出现种皮皱缩、发霉溃烂的现象(见图2)。通过查询中国天气网，发现种子发霉时间段里的最高气温为22 ℃，最低气温为7 ℃，日均温为14.2 ℃，相对湿度为67%，降水时间为1 d，积温为63.5 ℃。此条件下流苏种子在常温干燥贮藏和室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽试验过程中均极易发生霉变，在生产实践中应该注意温度与湿度的控制，从而避免发霉。

(a)室温干燥贮藏的流苏种子 (b)室温干燥贮藏的流苏种子内部霉变情况 (c)室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽的流苏种子图2 流苏种子发霉现象Fig.2 The mildew phenomenon of C.retusus seeds

2.5 致霉菌多样性分析

常温干燥贮藏和室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽的流苏种子测序覆盖度(goods coverage)结果均较高(为1)。常温干燥贮藏种子致霉菌群落样品中共鉴定与拼接出99条ASV序列，其Shannon指数(样品中的分类总数及其占比)和Simpson指数(群落内物种分布的多样性和均匀度)分别为3.04和0.8。室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽样品中只有35条ASV序列，Shannon指数、Simpson指数分别为0.27、0.06。常温干燥贮藏种子致霉菌群落多样性高于室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽样品，两者重复的ASV序列有18条。

2.6 致霉菌种类鉴定结果与分析

室内常温干燥贮藏的霉变种子中共鉴出40种致霉菌。其中帚状曲霉(Aspergilluspenicillioides)的丰度为33.93%，脂节担菌(Wallemiasebi)的丰度为31.20%；踝节菌(Talaromycesatroroseus)、圆锥曲霉(Aspergillusconicus)、Aspergillusglabripes、Zygoascuspolysorbophila、乔治亚青霉(Penicilliumgeorgiense)、朱黄篮状菌(Talaromycesminioluteus)的丰度则较低，分别为8.53%、1.10%、0.45%、0.42%、0.39%和0.22%。因此室内常温干燥贮藏种子中的致霉菌主要是帚状曲霉和脂节担菌踝节菌(见图3)。

图3 流苏种子致霉菌的相对丰度Fig.3 The relative abundance of mildew fungus in C.retusus seeds

室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽发霉种子中共鉴定出13种致霉菌。其中茄病镰刀菌(Fusariumsolani)的丰度最高，为97.30%。其他的真菌类型Pithyavulgaris、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、Fusicollaseptimanifiniscientiae、Tausoniapullulans、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、Fusariumlacertarum、帚状曲霉、脂节担菌的丰度分别为1.29%、0.34%、0.22%、0.10%、0.04%、0.03%、0.12%、0.12%，所占比例均极低。据此可知，湿沙催芽霉变种子上附着的致霉菌主要为茄病镰刀菌(见图3)。虽然帚状曲霉和脂节担菌在室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽发霉种子菌群中也存在，但丰度较低，这表明引起流苏种子室内常温干燥贮藏和湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽的主要霉变菌种不同。

3 讨论与结论

3.1 种子发霉现象分析

研究中流苏种子霉变高发期的时间段为4月中旬，通过观察分析发现流苏种子在日均温14.2 ℃，最高气温为22 ℃，相对湿度为67.00%的环境条件下易发生霉变。相关研究也表明，淀粉、油脂等含量高的种子在一定温度、湿度条件下容易发生霉变现象[8-10]。刘爱民等[8]在研究杂交水稻劣变特性时，考察了6个母本系品种的杂交种子，发现降雨高湿是杂交水稻种子霉变现象普遍存在的原因。杨书香等[10]基于武汉市四季温度和湿度设置4个不同的温度和湿度进行正交试验，研究花生的霉变情况，发现花生种子在18 ℃、70%的湿度条件下处理3 d后出现霉变现象，在18 ℃、95%的湿度条件下处理3 d后霉变率为30%，在28 ℃、90%的湿度环境中3 d霉变率达80%；初步鉴定霉变菌种为黄曲霉菌和黑曲霉菌。刘龙龙等[11]发现收获期的燕麦籽粒在夜间气温8～13 ℃、白天温度15～25 ℃且湿度较高的环境中易发生霉变。蒋淑儒等[12]通过观察发现湿度大的环境中油茶籽更容易发生霉变现象。

本研究中流苏种子千粒重为200.90g，净度为93.90%，含水量为13.35%，种子纵、宽的平均数分别为11.70、4.97 mm，种子质量检测结果表明该批种子质量良好[13-14]。TTC种子活力检测发现正常流苏种子生活力为81.82%，霉变后的生活力为44.00%，这表明室内干燥贮藏过程中发生霉变会导致部分种子失活、生活力下降。吸水率试验表明流苏种子萌发过程中所需水分没有受到种壳限制，但随着浸泡时间的增长出现了霉变现象；在室温湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽过程中，发霉现象严重无法发芽，因此在流苏种子发芽过程中亦应严格防霉。

3.2 致霉菌的危害及防治分析

基于高通量测序发现流苏树种子常温干燥贮藏过程中帚状曲霉和脂节担菌丰度最高。湿沙层积赤霉素处理湿沙催芽过程种茄病镰刀菌的丰度最高。帚状曲霉可以在极端干旱、低湿、盐渍和厌氧环境条件中生存，常见于室内灰尘、人体皮肤和干燥的食物等介质[15-16]。脂节担菌为节担菌属(Wallemia)的一种耐干旱性真菌，在海洋、土壤以及室内和室外广泛存在，可以引起甜点类食物(水果、蛋糕、面包等)、咸腌类食物(咸干鱼、咸花生、咸肉等)及烘干类食物腐败，同时可以引起苹果煤污病，是煤污病菌类群中唯一的一个担子菌种类[17-21]。茄病镰刀菌(Fusariumsolani)作为分解者在土壤、发霉腐烂的植物材料中广泛存在，是许多重要农作物、动物甚至人类身体中的病原体[22-26]。茄病镰刀菌可以侵染多种作物，引起植物发生根腐病、茎腐病等症状，比如丹参根腐病、苜蓿根腐病、菜豆根腐病、人参根腐病、百合枯萎病、薯干腐病、桉树枯萎病、橡胶树茎杆溃疡病、咖啡黑果病、大豆猝死症等多种疾病，造成巨大经济损失[25-28]。有研究表明茄病镰刀菌菌丝生长和产孢适宜碳源依次为淀粉、麦芽糖；适宜氮源依次为蛋白胨、牛肉膏、硝酸钾，最适合温度为25～30 ℃，最适pH为7～8，湿度对孢子萌发影响较大，完全光照有利于病原菌生长[29]。

为防止流苏种子在贮藏过程中发霉，务必严格控制种子含水量，同时应注意密封，以抑制旱生真菌的大量繁殖[30]。在流苏种子催芽前应严格对种子和基质进行消毒，发芽过程中如出现霉变现象，应及时施用杀菌剂如甲基硫菌灵可湿性粉剂、多菌灵等[31- 35]。