小儿解感颗粒HPLC指纹图谱及3种成分含量测定研究

董 宠 陈 斌 许 龙 曹 阳 黄顺旺 曹明成

小儿解感颗粒（国药准字Z20080492）是临床上常用的治疗小儿感冒的中药复方制剂。处方由柴胡、荆芥、桔梗、大青叶、黄芩、甘草组成，具有清热解表，利咽止咳之功效。主要用于感冒发烧，发热流涕，咳嗽喷嚏，咽喉肿痛等[1-2]。

指纹图谱具有整体性、专属性、可量化等特点，针对复方制剂多成分研究，可最大限度地提取指纹图谱信息，从而实现对中药质量的科学、准确评价[3-4]。近年来，就指纹图谱在中药的质量控制和评价方面开展了大量研究工作，对评估中药材质量优劣、真伪及保证其质量的一致性、稳定性具有重要意义，更为保障复方制剂质量提供了一条符合中药特色的评价方法[5]。本实验通过探索以简便的色谱方法、普通的高效液相仪器建立小儿解感颗粒的HPLC指纹图谱，测定多批次复方制剂中黄芩苷、甘草苷、甘草酸成分的含量[6-7]，以期为完善小儿解感颗粒的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（LC-20A型）；十万分之一电子分析天平（AG135 型）、百万分之一电子分析天平（XP6 型）；超声波清洗器（KQ-500DB型）。已上市10 批小儿解感颗粒样品，批号：2002001、2002005、2006002、2009003、2009007、2009008、2010003、2010004、2011001、2011002，由山东明仁福瑞达制药股份有限公司提供；黄芩苷（批号：110715-201821，含量94.2%：）、甘草酸铵（批号：110731-202021，含量：96.2%）、甘草苷（批号：111610-201908，含量：95.0%）均购自于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（SIGMA）均为色谱纯，实验用水为超纯水(自制)，甲酸及其他试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 色谱条件及色谱柱 Agilent 5 HC C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～55 min，5%～30%A；55～70 min，30%～45%A；70～80 min，45%～55%A；80～90 min，55%～60%A）；检测波长为270 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为35℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备 ①混合对照品溶液制备：取黄芩苷、甘草苷、甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释并定容至刻度，制成每1 mL含黄芩苷100 μg、甘草苷110 μg、甘草酸120 μg的混合对照品溶液，摇匀。②供试品溶液制备：取小儿解感颗粒适量，研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（500 W，40 Khz）30 min，放冷，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察 ①系统适用性试验：取空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，进行测定，记录色谱图。②精密度考察：精密取同一批次小儿解感颗粒（批号：2009008），按“2.2”内容下的制备过程同法制备供试品溶液，根据“2.1”色谱条件部分完成实验条件设置并连续检测6 次，分别计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。③重复性考察：精密取同一批次小儿解感颗粒（批号：2009008），照“2.2”内容下的制备过程制备供试品溶液，平行制备6 份，按“2.1”内容下的高效液相色谱条件测定，分别计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。④稳定性考察：精密取同一批次对照小儿解感颗粒按“2.2”内容下的制备过程同法制备供试品溶液，按“2.1”内容下的高效液相色谱条件，分别在0、3、6、10、24 h时进样测定，分别计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价 ①10 批样品指纹图谱检测：取10 批已上市小儿解感颗粒，按“2.2”内容下的制备过程依法制备供试品溶液，按“2.1”内容下的高效液相色谱条件分别测定，该样品所含成分色谱峰于90 min 洗脱完全。将不同批次样品色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（国家药典委员会，2012A）中，通过多点校正后进行色谱峰匹配及相似度分析。②指纹图谱共有峰的归属：按小儿解感颗粒处方和工艺制备单味药材及各缺味阴性供试品，照“2.2”内容下的制备过程同法制备供试品溶液，按“2.1”内容下的高效液相色谱条件进样检测。

2.5 指标性成分含量分析 ①指标峰专属性考察：根据小儿解感颗粒指纹图谱峰及甘草苷、黄芩苷、甘草酸对照品色谱峰，确定指纹图谱中3 种指标性成分色谱峰的位置；另按处方比例分别取缺黄芩、缺甘草药材适量，加水煎煮提取，经稀释过滤后作为缺黄芩和缺甘草的阴性对照样品，按“2.1”项下的色谱条件进样检测。②线性关系的考察：取甘草苷、黄芩苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释并定容至刻度，配制成每1 mL含甘草苷0.41 μg、黄芩苷2.01 μg、甘草酸铵0.15 μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。采用逐级稀释的方式，配制不同浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进样检测，以峰面积为纵坐标，以浓度（mg/mL）为横坐标，进行标准曲线的绘制，得到回归方程和相关系数。③精密度考察：制备一份对照品溶液，根据“2.1”项色谱条件连续检测6 次，分别计算各峰的峰面积RSD。④重复性考察：取同批次小儿解感颗粒，研细，按照供试品制备方法制备6 份样品，按“2.1”项色谱条件进样检测，得各指标性成分保留时间和含量RSD。⑤稳定性考察：取同一份供试品溶液，分别在0、3、6、10、24 h，按“2.1”项色谱条件进样检测，得各指标性成分的峰面积与0 h相比的变化值。⑥加样回收率考察：称取6 份已知含量的小儿解感颗粒样品，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品（与小儿解感颗粒中各成分含量相当）适量，按“2.1”项色谱条件进行检测。⑦含量测定：取10 批次的小儿解感颗粒样品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进行测定。

3 结 果

3.1 指纹图谱试验结果 ①系统适用性试验结果显示甘草苷、黄芩苷、甘草酸3 种指标成分的分离度均大于1.5，且理论板数按目标化合物色谱峰计均大于3000。结果见图1。②精密度：各共有峰的相对保留时间的RSD＜1.0%，相对峰面积的RSD＜3.0%，表明仪器精密度良好。③重复性：各共有色谱峰的相对保留时间RSD＜1.0%，相对峰面积RSD＜3.5%，表明本方法重现性良好。④稳定性：室温条件下的供试品，分别在0、3、6、10、24 h进行液相检测，各共有峰的相对保留时间RSD＜1.0%，相对峰面积RSD＜3.0%，表明室温条件下放置的供试品在24 h内稳定性良好。⑤10 批样品指纹图谱检测：共标识23 个共有峰并生成指纹图谱及共有模式指纹图谱。通过与对照品色谱峰保留时间比对，确认了峰9 为甘草苷、峰14 为黄芩苷、峰20 为甘草酸。10 批小儿解感颗粒指纹图谱各共有峰，以14 号黄芩苷色谱峰为参照峰（S），计算得各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD为0.00%～50.32%，每批样品与对照图谱的相似度为0.999～1.000。⑥指纹图谱共有峰的归属：对小儿解感颗粒物质群中各共有峰进行药材归属分析，物质群中的1 号峰为大青叶、柴胡共有峰；2，3，5，6，8 号色谱峰归属于大青叶药材；峰9、峰20 归属于甘草；峰4 为新生成的峰；峰7 归属于荆芥；10～19，21～23 号色谱峰归属于黄芩药材。对3 个色谱峰进行了指认，峰9 为甘草苷、峰14 为黄芩苷、峰20 为甘草酸。说明小儿解感颗粒的物质群均可清晰地追溯到药材，色谱峰归属明确。

图1 空白对照(A)、混合对照品 (B)和小儿解感颗粒供试品溶液(C)的HPLC图谱

3.2 指标性成分含量测定试验结果 ①指标峰专属性考察：阴性供试品色谱在相应的位置上未见相对应的色谱峰，阴性供试品无干扰，专属性强。②线性关系：甘草苷、黄芩苷、甘草酸在相应线性范围内，所测对照品溶液的浓度与3 种被测组分峰面积均存在良好的线性关系。其线性关系见表1。③精密度：3 种指标成分的峰面积RSD均小于2.0%，结果表明仪器的精密度良好。④重复性：3 种指标成分的含量RSD值均＜3.0%，表明该方法的重现性良好。⑤稳定性：室温条件下的供试品，分别在0、3、6、10、24 h进行液相检测，3 种指标成分的峰面积与0 h相比，峰面积变化值均小于2.5%，表明室温条件下放置的供试品在24 h内稳定性良好。⑥加样回收率：3种指标成分的加样回收率检测结果显示，平均加样回收率均在100.01%～100.78%范围内，RSD≤3%，结果见表2。⑦样品含量测定：10 批颗粒含量的测定结果见表3。

表1 指标成分线性回归方程

表2 甘草苷、黄芩苷、甘草酸加样回收率结果

表3 小儿解感颗粒中指标成分的含量（n=2，mg/g）

4 讨 论

在本研究中，我们结合文献及实验对流动相进行筛选，评估甲醇-酸水体系、乙腈-酸水体系，并对比了不同浓度的酸水条件，优选乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相体系完成梯度洗脱，同时结合现行版中国药典黄芩、甘草药材项下的指标性成分含量测定最佳吸收波长，采用高效液相DAD检测器对供试品溶液在不同波长条件下的峰强度、峰数目进行对比，发现波长在270 nm条件下，指纹图谱出峰数目最多、信号最强。另外，通过对Agilent 5 HC C18等色谱柱的对比，确定Agilent 5 HC C18色谱柱进行样品测定时，各峰的峰形良好、分离效果较好、图谱基线稳定。表明采用中药指纹图谱技术建立小儿解感颗粒指纹图谱检测方法，以一测多评的方法同时测定黄芩苷、甘草苷和甘草酸的含量，供试品处理及检测方法简便，可操作性强。

本实验以饮片-成品颗粒中主要物质群的量值传递关系为核心，评价物质群之间的相关性，仅指认甘草苷、黄芩苷、甘草酸3 个色谱峰并进行含量测定，而其他成分指认不足，后期需进一步完善各峰的归属，以评价制备工艺的科学性和物质群的批间质量一致性及可追溯性，为完善小儿解感颗粒的质量标准做好基础工作，确保药品的安全性、有效性和质量可控性[8-9]。