抗幽门螺杆菌四联疗法临床疗效和治疗前后肠道菌群变化

乔华双 毛玉娣 陈琦琦 吴星辰 丁西平

幽门螺杆菌（Hp）是一种革兰氏阴性、微需氧、螺旋形和有鞭毛的细菌，在全球范围内约一半人口被它感染[1]。Hp感染导致多种胃肠道并发症，如慢性胃炎、消化性溃疡，甚至胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病，因此该类细菌被纳入Ⅰ类致癌物[2]。肠道菌群在肠道内形成了一个复杂、动态变化且空间异质的生态系统，通过能量代谢、物质产生、免疫反应等方面维持肠道内环境的稳态，并影响疾病的转归[3]。本研究通过16SrDNA高通量测序比较抗Hp治疗过程中菌群变化和抗Hp治疗成功组与失败组之间的菌群差异，寻找导致根除失败的菌群。找出可能影响疗效的肠道菌群改变，为益生菌联合疗法提高Hp根除率提供临床依据，同时也为抗幽门螺杆菌治疗探索新的方案提供方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2021年12月-2022年4月在安徽省立医院就诊的幽门螺杆菌感染患者作为研究对象，本研究经安徽省立医院的伦理委员会审查同意且患者知情同意。①纳入标准：年龄18～65岁；呼气试验阳性患者；有明显消化道症状患者；既往无根除Hp治疗史。②排除标准：近1个月有抗生素、铋剂、PPI、益生元、益生菌及抗腹泻药物治疗史；对PPI、抗生素及铋剂过敏患者；患者患有严重肝肾疾病，以及其它影响肠道菌群构成的疾病；治疗及观察期间服用其它影响肠道菌群药物者；妊娠期、哺乳期妇女及患有严重精神疾病者。本研究共纳入符合标准的患者22例，年龄21～65岁，男性13例，女性9例。临床表现主要有腹痛9例，恶心8例，反酸9例，腹胀12例，嗳气6例，腹泻3例，食欲不振4例，便秘1例，无无症状感染者。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集符合标准患者的年龄、性别及临床表现，并记录患者服药过程中不良反应及服药后临床症状改善情况。患者服用药物基本信息及注意事项见表1。

表1 患者服用药物基本信息及注意事项

1.2.2 16SrDNA测序方法 收集患者治疗前、治疗2 周及停药1 个月后的大便标本1～3 g于粪便盒中，2 h内送至-80°冰箱进行储存。对微生物组样本，选用合适的总DNA提取方法，采用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。以微生物核糖体RNA或特定基因片段等目标序列为靶点，对rRNA基因可变区进行PCR扩增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，使用MiSeq测序仪进行双端测序，测序长度为200～450 bp。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.0统计软件对数据进行分析，正态分布计量资料用均数±标准差（）表示，计数资料用n（%）表示，两组之间比较采用t检验，多组之间采用F检验；非正态分布计量资料以中位数和四分位数表示，两组之间比较采用Mann-Whitney U检验，多组之间采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗效果及治疗过程中患者临床症状改变情况分析 治疗成功18 例，治疗失败4 例，幽门螺杆菌根除率81.82%。患者在治疗过程中均规律服药，无漏服、停药及合并其它用药情况。患者在治疗后临床症状较前改善，主要表现为恶心、反酸、腹痛腹胀及食欲不振症状较前改善。

2.2 肠道菌群α多样性变化 根据16SrDNA测序结果，使用Chao1 指数、Simpson指数、Shannon指数来分析幽门螺杆菌感染患者治疗前后肠道菌群α多样性变化，治疗前、治疗2 周、停药1 个月后α多样性指数差异均有统计学意义（P＜0.05），比较治疗成功组与治疗失败组在停药1 个月后的肠道菌群，发现治疗成功组与失败组α多样性指数差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组不同治疗时间α多样性指数比较

2.3 肠道菌群显著性差异分析 根据16SrDNA测序结果，幽门螺杆菌感染患者肠道菌群优势菌门主要为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门。幽门螺杆菌根除治疗过程中，厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、糖细菌门、梭杆菌门序列数发生改变，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。幽门螺杆菌感染患者优势菌属主要有拟杆菌属、布劳特氏菌属、粪杆菌属、瘤胃球菌属。幽门螺杆菌根除治疗过程中，布劳特氏菌属、志贺菌属、粪杆菌属、普雷沃菌属、颤螺菌属、梭菌属序列数发生改变，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 治疗过程中肠道菌群在门水平差异性比较

2.4 治疗成功组与失败组菌群差异分析 根据16SrDNA测序结果，比较治疗成功组与治疗失败组在停药1 个月后的肠道菌群，发现两组门水平治疗差异无统计学意义（P＞0.05），见表5，与治疗成功组相比，治疗失败组多尔氏菌属（Dorea）序列数升高，差异有统计学意义（Z=-2.457，P=0.014），治疗失败组双歧杆菌属序列数降低，差异有统计学意义（Z=-2.533，P=0.011），见表6。

表6 两组在属水平差异性比较

3 讨 论

幽门螺杆菌是一种革兰阴性细菌，Hp利用其运动性、趋化性、尿素酶产生和其他机制来适应管腔的酸性条件，并在上皮细胞表面狭窄处定植。由于Hp感染会导致胃内微环境改变，并且通过其产生的毒力因子等对胃黏膜上皮细胞造成损伤，继而导致胃内炎症甚至癌症，在Hp感染早期，根除治疗是预防疾病发生的有效措施[4]。Hp定植在胃黏膜上皮细胞，可以引起胃内pH改变及导致胃黏膜上皮损伤，Hp通过改变胃内pH、内分泌及免疫功能调节进而影响下游肠道菌群改变。

本研究患者在治疗2周及停药1个月肠道菌群的α多样性均降低，表明在抗幽门螺杆菌药物治疗过程中导致肠道内物种多样性下降，肠道内物种多样性下降会继而导致肠道内菌群紊乱。而治疗成功组与治疗失败组在α多样性无显著性差异（P＞0.05），说明不同治疗效果对菌群多样性的影响并不明显。治疗过程中志贺菌属等菌属序列数升高，而粪杆菌属、普雷沃菌属、颤螺菌属等产生短链脂肪酸的优势菌属序列数降低，这些菌群的丰度发生改变，会导致菌群紊乱。志贺菌属是一种促炎细菌，可产生LPS，刺激炎症因子的分泌[5]。在抗Hp治疗过程中，产生短链脂肪酸的菌属序列数在治疗过程中较前减低，可能导致肠道黏膜屏障受损和肠道炎症。SCFA，尤其是丁酸，是维持结肠上皮细胞的重要底物，丁酸是结肠细胞利用的首选燃料，体内丁酸螯合的主要部位是肠上皮细胞。紧密连接蛋白本身调节管腔和肝门系统之间的细胞内分子高速公路。在结肠中产生的SCFA中，丁酸盐是紧密连接蛋白最重要的调节剂，蛋白质是紧密连接组件的关键组成部分，并且已被证明可以通过增加claudin-1 和Zonula Occludens-1（ZO-1）的表达和occludin再分布来增强肠屏障功能。细菌脂多糖增加会触发免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞和库普弗细胞）中的Toll样受体4（TLR4）介导的促炎级联反应，丁酸被证实可以抑制炎症反应[6]。丁酸可通过抑制幽门螺杆菌的生存能力和毒力来减少幽门螺杆菌诱导的炎症，并可能减少与幽门螺杆菌感染小鼠肠道微生物群相关的炎症[7]。本研究发现，抗幽门螺杆菌治疗过程中，肠道内优势菌属和多样性发生改变，导致致病菌生长和产生短链脂肪酸菌属减少，肠道屏障作用减弱及炎症水平升高，因此在根除幽门螺杆菌治疗过程中需要关注肠道菌群紊乱问题，肠道菌群发生紊乱后，肠道内的稳态受到破坏，可能导致机会性感染，因此我们在抗幽门螺杆菌治疗过程中需要关注肠道菌群紊乱，并及时做出应对之策。

本研究中根据16SrDNA测序结果，比较治疗成功组与治疗失败组在停药1 个月后的肠道菌群，与治疗成功组相比，治疗失败组多尔氏菌（Dorea）属序列数升高，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗失败组双歧杆菌属序列数降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。多尔氏菌属丰度高的患者肠道炎症反应更重，容易出现肠道黏膜的损伤，这类肠道致病菌的过度生长，可能会导致根除治疗的失败。双歧杆菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，容易通过附着在肠道上形成菌落，对胃肠道环境有抵抗力，它在肠道菌群中生存时会产生各种抗菌肽。双歧杆菌主要作用是提高抗炎细胞因子水平，降低促炎细胞因子水平。使用双歧杆菌后，测乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸含量均显著提高，改变了肠道菌群的组成，肠道菌群的丰度和多样性较前升高[8]。本研究中治疗失败组双歧杆菌序列数较成功组降低，说明双歧杆菌序列数降低，产生短链脂肪酸相对减少，导致肠道通透性升高和炎症水平升高，可能最终导致抗幽门螺杆菌治疗失败。益生菌可以改善肠道微生物平衡，通过预防或减轻肠道感染、癌症、过敏性疾病和心血管疾病对宿主发挥有益作用。并且可以促进肠道成熟和完整性，抵御病原体并调节免疫系统[9]。本研究中治疗失败组双歧杆菌菌属序列数较治疗成功组低，双歧杆菌的丰度减低导致短链脂肪酸的减少，肠道屏障作用减少，促炎因子增多，炎症水平升高，最终可能导致治疗失败。为益生菌联合疗法提高治疗根除率提供临床依据，同时也为抗幽门螺杆菌治疗探索新的方案提供方向。

综上所述，本研究中发现在抗幽门螺杆菌治疗过程患者的肠道菌群优势菌群发生改变，导致肠道菌群紊乱。治疗成功组与失败组之间的菌群差异，表现为致病菌的序列数增加和产生短链脂肪酸菌群的序列数降低，导致肠道屏障作用减弱，促炎因子增多，炎症水平升高，最终可能影响根除效果，导致根除治疗失败。因此在治疗过程中需要关注肠道菌群紊乱，为益生菌联合疗法提高Hp根除率提供临床依据。