水生微宇宙研究热点及毒性对比与预测分析

吴 凡，王晓南*，王旭升，王佳琪，张 聪，刘征涛

1.中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

2.海油环境科技（北京）有限公司，北京 100027

微宇宙(microcosm)被称为模型生态系统，即尽可能地模拟自然生态系统[1]，把复杂多变的自然生态系统加以简化并对其过程进行模拟，但是模拟的微宇宙并非完全复制自然生态系统；此外一些难以到达的特殊生态系统，如沙漠、远洋和火山口等也可以通过微宇宙进行研究.微宇宙可以分为陆生微宇宙、水生微宇宙以及湿地(水陆生)微宇宙三类[2].

随着人类社会的发展，污染物的排放对水生态系统造成了危害[3-4]，相较于单物种毒性实验，水生微宇宙作为模型生态系统，可以进行群落水平对污染物响应的研究[2,5]，在污染物的生态毒性以及污染物与环境DNA(eDNA)的降解研究中得到应用.孙健等[6]采用35 d 的水生微宇宙毒性实验，得出三唑酮对中华薄壳介(Dolerocypris sinensis)、隆线溞(Daphnia carinata)等8 种浮游动物组成群落的无效应浓度(NOECcommunity)＞2 078.88 μg/L.Essid 等[7]采用水生微宇宙系统研究了内分泌干扰物苯甲酸雌二醇对线虫(nematodes)等小型底栖生物群落的影响，发现高浓度(12.9 ng/L)组会造成线虫群落的Shannon-Wiener指数下降.为充分反映污染物对群落的生态毒性，袁丙强等[8]扩充了生态位，选用大型溞(Daphnia magna)、萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)、羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)等浮游生物组成群落，开展了63 d 的水生微宇宙毒性实验，结果显示，三唑磷对浮游生物群落的NOECcommunity和最低观察效应浓度(LOECcommunity)分别为17.5 和52.5 μg/L.为了全面探索有毒污染物的迁移转化规律，水生微宇宙技术也被引入污染物的降解转化等研究中.Yi 等[9]采用小球藻(Chlorellasp.)与钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的微宇宙系统开展了苯酚的降解研究，发现小球藻与钩虫贪铜菌共存时对苯酚的降解能力增强.McKeever等[10]采用水生微宇宙实验发现，加入好氧微生物群落后二溴化乙烯的降解速率是之前的8 倍.但这些实验过程均未考虑环境因素的影响，Mouafo 等[11]将环境因素纳入实验发现，在酸性水生微宇宙环境中高温不利于铜绿假单胞菌降解聚乙烯.为了计算生态系统的物种多样性，近年来eDNA 技术常被用于分析环境中的目标物种[12]，然而受到环境因素的影响，eDNA的降解会影响检测结果的可靠性[13]，水生微宇宙可以模拟不同的环境条件，有助于研究环境因素对eDNA 降解的影响.Strickler 等[13]通过水生微宇宙实验发现，在低温(5 ℃)、低紫外线辐射以及碱性条件下，牛蛙蝌蚪的eDNA 降解速率最低；而Wei 等[14]通过水生微宇宙实验发现，高浓度细菌可以增加日本大螯蜚(Grandidierella japonica) eDNA 的降解速率.

在水生生物毒性实验中，水质参数，如pH[15-16]、硬度[17-18]和溶解氧[19]等均会对污染物的毒性效应产生影响，毒性预测模型的研究可以定量水质参数对毒性效应的影响.Schlekat 等[20]成功构建了镍对水中大型溞和隆线溞的毒性预测模型，其中包含的水质参数有pH、硬度及溶解有机碳.Wang 等[21]将可溶性有机碳作为影响因子构建了水体中铜对鲤鱼(Cyprinus carpio)的毒性预测模型，并使用急性毒性实验数据对预测模型进行了验证.

微宇宙作为一种新型模型生态系统，应用领域逐渐增多.因此，该研究采用CiteSpace 软件，对国内外所有涉及微宇宙的文献进行计量分析，分析国内外水生微宇宙的研究现状和热点趋势；搜集基于水生微宇宙的生态毒性数据，并与单物种毒性实验数据进行对比分析，分别构建了通过单物种及水质参数预测微宇宙毒性数据的回归模型，以期为水生微宇宙的深入研究提供参考.

1 标准水生微宇宙实验体系及实验系统

在标准微宇宙系统的构建中，系统介质以及沉积物一般采用T82MV 培养液以及由石英砂、几丁质和纤维素制成的人工沉积物[5-6].由图1 可见：在向经过灭菌处理的容器中加入培养液以及沉积物3～7 d 后加入浮游植物，约一周时间后加入浮游动物；在全部受试生物接种入微宇宙3～7 d 后投入受试物质，记当天为实验的第0 天[7].

图1 标准水生微宇宙实验流程Fig.1 The flow chart of standard aquatic microcosm test

基于不同研究目的，构建的微宇宙系统也会存在差异，现阶段主要的微宇宙实验系统如表1 所示.依据微宇宙内部循环特征，将水循环纳入体系的微宇宙系统称为流动微宇宙[1]，反之则为静止微宇宙.其中，静止微宇宙使用较为广泛，实验时间范围为22～281 d，实验容器体积较小.流动微宇宙实验时间范围为59～77 d，实验容器体积较大，一般参考加拿大奎尔夫大学的室外微宇宙系统[30]进行设计.受试生物方面，一般采用甲壳类和轮虫(rotifers)等浮游动物，绿藻、蓝藻和硅藻等浮游植物、沉水植物等.此外，受试生物的种类也受实验容器体积的影响，容器体积较大的微宇宙会涉及沉水植物以及大型无脊椎动物，其中沉水植物主要为金鱼藻属(CeratophyllumL.)或狐尾藻属(MyriophyllumL.)等多年生草本植物，大型无脊椎动物主要为钩虾(Gammarussp.)、椎实螺(Lymnaeasp.)和石蛭(Erpobdellasp.)等.

表1 微宇宙系统以及相应受试生物Table 1 Microcosm system and corresponding test organisms

2 文献数据分析

2.1 数据的获取

为了更好地探索国内外水生微宇宙领域的研究进展，基于中国知网、Elsevier 以及Web of Science 数据库进行了文献数据搜集，并对搜集到的中英文文献全记录数据使用CiteSpace 进行关键词聚类分析.在中国知网数据库中以“水生微宇宙”“模拟水生生态系统”以及“生态毒理学”为主题关键词分别进行检索，从1990 年至2022 年8 月10 日共得到105 篇有效文献.在Web of Science 核心数据集中以“aquatic microcosm”以及“ecotoxicology”为主题关键词进行检索，从1962 年至2022 年8 月10 日共得到2 115 篇有效文献，其中，国内文献198 篇，国外文献1 917 篇.

2.2 国内外发文量对比

以每10 年为时间切片单位，将国内外文献数据集各时间切片内的发文量进行对比(见图2).由图2可见，国内水生微宇宙领域的研究相对较为滞后，从21 世纪10 年代开始国内发文量有显著增加趋势，到21 世纪20 年代后国内发文量占比已从21 世纪10年代的16.1%提至26.1%，表明国内近些年关于微宇宙的研究正在迅速发展.国外在20 世纪60-80 年代开始对水生微宇宙进行探索，到90 年代后相关发文量显著提升.由于水生微宇宙可以模拟自然生态系统的特性，该领域的研究热度越来越高，21 世纪20 年代的总发文量已经接近20 世纪90 年代的总发文量.

2.3 关键词聚类图、时间线图分析

论文关键词是对论文内容的高度总结，可以反映文章的研究主题以及主要研究内容，也具有较好的继承以及延伸性，因此对关键词的分析可以更好地把握某一研究领域的发展趋势以及当下研究热点.

中国知网数据库关键词聚类如图3(a) 所示，聚类模块值(Modurality Q)=0.857 8(＞0.3)，聚类平均轮廓值(Mean Silhouette)=0.638 6(＞0.5)，表明聚类显著.聚类标签序号越小，表示该聚类下包含的关键词数量越多，同一聚类中的关键词联系较为密切，选取前10个聚类进行展示.由图3(a)可见，与水生微宇宙相关的中文文献研究主题多与宏观层面的生态系统层级相关，部分选用微生物作为实验对象.

图3 国内水生微宇宙研究领域文献关键词分析Fig.3 Key words analysis map in domestic literatures about aquatic microcosm

由图3(b)可见，多数聚类在近几年较为缺乏，相关实验仍需进一步拓展.在聚类“#1 富营养化”“#3 微宇宙系统”“#4 微生物”中分别发现了关键词“三唑磷”“铜离子”和“恩诺沙星”等，已有学者采用水生微宇宙进行相应污染物的生态毒理实验[6,37-38]，表明国内文献中生态毒理已成为水生微宇宙研究领域的热点之一.

Web of Science 数据库关键词聚类如图4(a)所示，聚类模块值(Modurality Q)=0.454(＞0.3)，聚类平均轮廓值(Mean Silhouette)=0.732(＞0.7)，表明聚类显著.“#0 Dynamics(动态)”和“#1 Ecotoxicology(生态毒理学)”是包含关键词数量排名前二位的聚类，在数据库中分别检索到1 008 和539 篇相关文献.在其他聚类如“#2 Bioaugmentation(生物强化)” 和“#4 Impact(影响)”中也包含了“rhizosphere(根际)”“silver nanoparticle(纳米银离子)”等生态毒理常用的关键词.如Lin 等[26]在水生微宇宙中研究了亚微米塑料对植物根际微生物的毒性效应；Böttcher 等[39]采用微宇宙毒性实验，通过21 d 的暴露实验研究了异丙隆对浮萍(Lemna minor)根际的影响；还有许多学者采用水生微宇宙进行了纳米银离子的生态毒性实验[40-44].这表明在其他聚类中也包含与生态毒理学密切相关的关键词，综合中英文献关键词聚类分析可以看出，生态毒理学在水生微宇宙的研究中占比较大.

图4 国外水生微宇宙研究领域文献关键词分析Fig.4 Key words analysis map in international literatures about aquatic microcosm

英文文献关键词时间线图〔见图4(b)〕显示，第一篇水生微宇宙研究文献于20 世纪60 年代发表，但20 世纪90 年代之前水生微宇宙相关文献较少，在90 年代其数量显著增长，因此包含关键词较多的聚类从90 年代开始计算.其中，聚类“#0 Dynamics(动态)”包含关键词数量最多，从20 世纪60 年代至今一直有相关研究，且持续有新研究方向的关键词出现在聚类中.动态代表了生物体对生态系统生境的所有适应性反应[45]，以及生态系统本身与生物体通过相互作用所形成的进化机制[46-47]，因此相关实验涉及范围广泛，需要跨学科的研究方法，聚类“#0 Dynamics(动态)”的关键词涉及“litter decomposition (凋落物降解)”“ecosystem function (生态系统功能)”“species richness(物种丰富度)”等领域研究.聚类“#1 ecotoxicology(生态毒理学)”的文献数量较多，但近阶段没有新关键词出现在该聚类中，这可能与生态毒理联系较为密切的关键词出现在其他聚类中有关，如“#0 Dynamics(动态)”“#4 Impact(影响)”和“#8 Microbial communities(微生物群落)”中出现的“Risk(风险)”，以及“#5 Antifouling(防污)”中出现的“oxidative stress(氧化压力)”等.这表明水生微宇宙作为模型生态系统，相关实验逐渐包含生态系统内部更多的生态学进程，并向交叉学科的研究发展，不局限于单一的研究方向.通过对国内外水生微宇宙领域文献关键词聚类进行对比(见表2)可以发现，国内外都开展了水生微宇宙的群落影响、微生物实验，但国内更多集中在生态系统宏观层面的实验，国外除了宏观层面的实验外，也开展了生态毒理学和微观层面的实验.

表2 国内外水生微宇宙文献关键词聚类对比Table 2 Comparison of keyword clusters in domestic and foreign literatures about aquatic microcosm

3 基于微宇宙的毒性数据分析

从上述文献聚类结果可以看出，生态毒理是采用微宇宙进行实验的主要研究方向之一.传统的生态毒理实验一般是基于单一物种对污染物进行剂量-效应评估.在20 世纪80 年代研究[48-49]发现，单物种毒性实验结果无法用于评估生态系统层级的反应，因为物种在生态系统中会参与各种生态学进程，并受到物种间相互作用以及非生物部分相互作用的影响，所以基于单物种的毒性实验并不能完全反映污染物对生态系统中该物种产生的影响.鉴于单物种毒性实验的局限性，需要运用更接近自然生态系统的实验方式，因此水生微宇宙技术被引入到生态毒性实验当中.此外，水质参数会对水生微宇宙中污染物的毒性效应产生影响.因此，该研究进一步开展了基于微宇宙生态毒性数据的研究，比较了单物种毒性实验和微宇宙毒性实验两种实验所得毒性值的差异，并分析了两种毒性实验所得毒性值的联系，以及水质参数对微宇宙毒性效应的影响.

3.1 数据的获取、筛选和处理

对基于2.1 节搜集的中文文献进行筛选，保留包含生态毒性数据以及对应水质参数的文献并对数据进行整理；采用Elsevier 和Web of Science 数据库以“aquatic microcosm”和“toxicity”为主题对英文文献中水生微宇宙的生态毒性数据以及对应的水质参数数据进行搜索整理.并在上述数据库和美国ECOTOX数据库中分别搜索微宇宙毒性实验涉及污染物对应的单物种毒性实验数据，搜集到的数据包含NOEC、LOEC(最低观察效应浓度)、EC10和EC50.

由于不同污染物和物种的毒性数据差异较大，为使数据呈正态化分布，对所有搜索得到的毒性数据进行对数处理.对部分水质参数缺少的数据，使用R 4.2.1 以及RStudio 软件中的“mice”程序包进行多重插补，这是一种基于重复模拟的处理缺失值的方法，在土壤性质参数[50]以及水质参数[51]等方面具较好的填补效果.

3.2 单物种毒性数据与微宇宙毒性数据的对比分析

为确保实验环境条件基本一致，分别选取采用标准实验准则(如OECD 202 等)进行单物种毒性实验以及采用美国材料与试验协会准则ASTM E 1366-02进行微宇宙毒性实验的文献，并进一步对文献中相同暴露时间下单物种[52-59]和微宇宙[31,34-36,60-63]两种毒性实验得出的毒性指标(NOEC、LOEC、EC10和EC50)分别计算平均值，如两种实验方式下阿特拉津对伊乐藻(Elodea canadensis)的EC50(14 d)、氯乙酸对西伯利亚狐尾藻(Myriophyllum sibiricum)的EC50(4 d)、多菌灵对触角豆螺(Bithynia tentaculata)的NOEC(28 d)等.由于相同暴露时间下可选择数据较少，NOEC、LOEC 和EC10的平均值包含6 组数据，EC50平均值包含9 组数据.对比分析(见图5)发现，微宇宙毒性实验数据平均值较单物种毒性实验平均值降低了56%，其中两种实验方式下的NOEC、LOEC 和EC10平均值均存在显著差异(微宇宙毒性实验结果较单物种毒性实验结果降低了49%，t检验，P＜0.05)，EC50平均值也存在显著差异(微宇宙毒性实验结果较单物种毒性实验结果降低了64%，t检验，P＜0.01).结果表明，在种间相互作用的影响下物种对污染物更为敏感.

图5 单物种毒性实验和微宇宙毒性实验毒性平均值的对比Fig.5 Comparison of mean toxicity data between single species test and microcosm test

种间作用的影响导致单物种毒性实验和微宇宙毒性实验所得毒性值存在显著差异，因此本研究分别选取两种实验的9 组NOEC (LOEC、EC10)和EC50数据进行回归分析构建回归预测模型(见图6).由图6可见，单物种毒性实验和微宇宙毒性实验的毒性数据之间呈显著正相关〔NOEC (LOEC、EC10) 数据的P＜0.05，EC50数据的P＜0.01〕.风险评估的常用评价标准一般基于单物种毒性实验所得毒性值，但污染物进入生态系统后的毒性效应需考虑群落水平的影响[48-49]，单物种毒性实验所得毒性值无法充分反映群落水平的间接作用，因此基于群落水平的微宇宙毒性实验所得毒性值在风险评估中更加可靠[59].图6 中显示的2个预测模型可以通过单物种毒性试验所得毒性值推导出微宇宙毒性试验中相应物种的毒性值，表明该模型可为基于群落水平的生态风险评估提供参考.

图6 毒性数据回归分析Fig.6 Regression analysis of toxicity data

3.3 水质参数对微宇宙毒性效应的影响

采用R 4.2.1 软件，基于逐步回归分析剔除了相关性较差的水质参数后，构建了水生微宇宙中不同水质参数对浮游动物[24,27,35-36]以及被子植物[23,29,31,62,64-65]的毒性数据预测模型(见表3).由表3 可见，在水生微宇宙毒性实验中有机杀菌剂(四环素类、卤乙酸类、三嗪类和卤代烃类)对浮游动物的毒性主要受溶解氧和pH 影响(R2为0.822)，对被子植物的毒性主要受pH 和碱度的影响(R2为0.984)，其中，溶解氧和pH 均增强了有机杀菌剂对浮游动物的毒性效应，pH和碱度均减弱了其对被子植物的毒性效应.研究[66]发现，pH 等土壤参数以影响污染物生物有效性的方式对毒性效应产生影响，其构建了基于pH 等土壤性质的毒性预测模型，为生态风险评估和毒性预测提供支持.在水质参数的影响研究方面，US EPA 采用基于温度和pH 的模型来推导氨氮水质基准[67]，另有学者构建了pH 对有机杀菌剂五氯酚的生态毒性预测模型[68].研究中多选用pH 等水质参数构建毒性预测模型，是因为其通过影响污染物在水体中的有效态含量，从而影响其对水生生物产生毒性效应的有效含量，即生物有效性.

表3 水质参数预测毒性数据回归模型Table 3 Regression models for predicting toxicity data from water quality parameters

该研究采用文献数据[30,31,61-62,69-72]对预测模型结果进行验证，其中，选用8 组浮游动物数据、4 组被子植物数据进行验证(用于验证的数据未被用于模型的构建)，并对预测结果进行分析(见图7).由图7 可见，模型预测值和微宇宙毒性实验实测值相似，且均在95%预测带内，表明该模型可对上述有机杀菌剂对浮游动物和被子植物的毒性效应进行预测，已有学者对土壤毒性预测模型进行了相似结果验证[73-75].后续数据的补充可以更好地验证该模型的精确度，为基于微宇宙的生态系统风险评估提供参考.

图7 模型结果验证Fig.7 Verification of model results

4 结论

a) 根据聚类与时间线分析发现，生态毒理学是水生微宇宙的重要研究方向，近年来微宇宙毒性实验逐渐向交叉学科的方向发展，不再局限于单一的研究方向.

b) 基于15 组相同暴露条件下的微宇宙与单物种毒性实验数据，经过统计分析发现，微宇宙毒性实验的毒性数据(NOEC、LOEC、EC10和EC50) 均显著低于单物种毒性实验的毒性数据(t检验，P＜0.05)，其中微宇宙毒性实验数据平均值总体降低了56%，表明物种在种间关系的影响下对污染物更为敏感；同时构建了单物种与微宇宙毒性实验所得毒性值的回归模型，发现该模型可以较好地通过单物种毒性实验所得毒性值对微宇宙毒性实验的毒性值进行预测(P＜0.05).