miRNA150-5p在甲状腺乳头状癌中的表达及诊断价值

李璇 赵雯钰 郭毅婷 贺亮 李军红 张艳芳

1郑州大学第二附属医院，郑州 450014；2郑州大学附属洛阳中心医院内分泌科，洛阳 471099；3郑州大学附属洛阳中心医院甲乳外科，洛阳 471099；4郑州大学附属洛阳中心医院病理科，洛阳 471099

甲状腺结节非常普遍，约1/3的人中患有甲状腺结节，其中5%～15%为恶性结节［1］。近几十年来，甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）发病率在我国呈快速上升趋势，尤其是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）［1-2］。因此，评估甲状腺结节的性质是一个关键的临床问题。目前，细针穿刺活检（fine needle aspiration biopsy，FNAB）是甲状腺结节主要的诊断方法［3］。然而，在20%～30%的病例中，FNAB标本的细胞学发现并不确定［4-5］，使甲状腺结节的诊断陷入困境。对于无法明确性质的结节，因存在恶性风险，患者多数会接受手术治疗。据估计，高达50%的甲状腺结节手术是不必要的［6］。

研究表明，分子、遗传以及环境因素等都与TC的发生、发展有关［7-8］。miRNA是一类长度约20个核苷酸的小型非编码单链RNA，可与特定mRNA的3′-非翻译区（3′UTR）结合，干扰细胞增殖、迁移、凋亡和分化［9］。miRNAs在多种文献中被提出作为癌症通路的调控因子，并作为癌症诊断的预测性生物标志物，包括肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等［10-12］。miRNA150-5p被报道可调控多种癌症的生物学和病理学进程，是细胞生长、转移和凋亡的重要介质［13-14］。但是，笔者查阅文献发现，miRNA150-5p在PTC中的表达方式未见报道。

在本研究中，笔者检测了miRNA150-5p在PTC组织、癌旁组织及良性甲状腺结节（benign thyroid nodule，BTN）组织中的表达水平，并分析miRNA150-5p鉴别诊断甲状腺结节性质的临床价值。

资料与方法

1.研究对象

选择2021年10月至2022年1月在郑州大学附属洛阳中心医院住院的43例PTC患者和19例BTN患者为研究对象。纳入标准：⑴经术后病理检查明确病理类型；⑵术前未接受放疗、化疗及免疫治疗。排除标准：⑴合并严重的肝肾功能不全；⑵合并严重的心肺功能不全；⑶合并感染性疾病；⑷合并其他恶性肿瘤。本研究经郑州大学附属洛阳中心医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.临床资料收集

⑴收集患者一般资料，包括年龄、性别。⑵禁食至少8 h后，早晨用真空采血管采集外周静脉血8 ml，将血液标本送至检验科，由郑州大学附属洛阳中心医院检验科工作人员按标准化流程检测游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、甲状腺球蛋白（Tg）、癌胚抗原（CEA）、降钙素（CT）。⑶甲状腺超声检查由2位具有5年以上经验的医师进行。超声图像分析结果包括：纵横比（＜1或≥1）、边界（清晰或不清晰）、包膜（不受侵犯、受侵犯）、回声（其他回声、低回声）、微小钙化（无、有）和甲状腺影像报告与数据系统（TI-RADS）分级（＜4级或≥4级）。

3.RNA提取和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）

将肿瘤组织、癌旁组织（距离肿瘤组织边缘约2 cm）和良性组织采集在一个2.0 ml的Eppendorf管中，并加入1.5 ml RNAlater液（Invitrogen），然后储存在-80 ℃。根据制造商的方案，使用RNAiso Plus（Takara）从新鲜组织中提取RNA，并使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara）逆转录合成cDNA。U6作为内参基因。将TB Green Advantage RT-qPCR Premix Kit（Takara）用于miRNA150-5p的qRT-PCR。进行3次RT-qPCR，并使用2-ΔΔCt法计算表达水平的变化。内参基因U6正向引物：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC，反向引物TGGAACGCTTCACGAATTTGCG。miRNA150-5p引物序列：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG（生工生物工程公司）。

4.统计分析

采用SPSS 24.0软件和GraphPad Prism 9.0.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两独立组间比较采用Mann-WhitneyU检验，两配对组间比较应用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料以率（%）的形式表示，组间比较采用χ2检验。采用单因素和多因素logistic回归模型分析PTC的影响因素。采用受试者工作特征曲线（ROC）分析miRNA150-5p预测PTC的诊断效能，得到ROC下面积（AUC）、灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.PTC组和BTN组的临床资料

PTC组年龄小于BTN组，PTC组TSH水平明显高于BTN组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两组性别和FT3、FT4、TPOAb、TgAb、Tg、CEA、CT水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。PTC组纵横比≥1、边界不清、包膜受侵犯、TI-RADS分级≥4级的比例明显高于BTN组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 PTC组与BTN组临床资料比较

2.miRNA150-5p在PTC组织的表达量低于配对的癌旁组织

miRNA150-5p在PTC组织的表达水平低于配对的癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1A）。癌症基因组图谱（TCGA）RNA-Seq数据库进一步支持了这一观点：与配对的癌旁组织相比，PTC组织中miRNA150-5p的表达量显著较低（P＜0.05）（图1B）。

图1 A：miRNA150-5p在PTC及配对癌旁组织中的表达。B：癌症基因组图谱RNA-Seq数据库中miRNA150-5p在PTC及配对癌旁组织中的表达

3.miRNA150-5p在PTC组织中的表达量低于BTN组织

miRNA150-5p在PTC及BTN组织中的相对表达量分别为2.032（0.173，7.329）和13.17（6.031，93.7）；与良性受试者相比，PTC组织中miRNA150-5p表达水平较低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2A）。为了进一步确定miRNA 150-5p在甲状腺肿瘤组织中的表达，使用TCGA RNA-Seq数据库研究了514例PTC和59例正常甲状腺组织中miRNA150-5p的表达水平；如预期，miRNA150-5p在PTC组织中的表达量显著低于正常对照组（P＜0.05）（图2B）。

图2 A：miRNA150-5p在PTC及BTN组织中的表达。B：癌症基因组图谱RNA-Seq数据库中miRNA150-5p在PTC及正常组织中的表达

4.单因素和多因素logistic回归模型分析PTC的影响因素

单因素logistic回归分析显示，miRNA150-5p表达量、年龄、TSH水平、纵横比≥1、边界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分级≥4级与PTC有关（均P＜0.05），见表2。

表2 43例PTC患者影响因素的单因素分析

将甲状腺结节的良恶性作为因变量，纳入miRNA150-5p表达量、年龄、TSH、纵横比≥1、边界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分级≥4级构建多因素logistic回归方程，结果显示，miRNA150-5p表达量是PTC的独立影响因素，miRNA150-5p表达量越高，发生PTC的风险越小，见表3。

表3 43例PTC患者影响因素的多因素分析

5.miRNA150-5p在PTC中的潜在诊断价值

利用ROC评估miRNA150-5p水平诊断PTC的准确性。ROC下面积（AUC）为0.797（95%CI=0.689～0.905，P＜0.001）。进一步分析发现，miRNA150-5p预测PTC的灵敏度、特异度和准确度分别为67.44%、89.47%和74.19%，阳性预测值和阴性预测值分别为93.55%、54.84%。见图3、表4。

图3 受试者工作特征曲线分析miRNA150-5p对43例甲状腺乳头状癌患者的诊断价值

讨论

在本研究中，笔者分析了PTC患者的一些临床特征，结果显示，与BTN患者相比，PTC患者更年轻，TSH水平更高，这与以往的研究一致［15-16］。Zheng等［17］分析56篇研究发现，PTC患者血清TSH水平明显高于BTN患者，PTC组血清TSH水平约为BTN组的1.44倍，东亚人为1.39倍，白种人为1.72倍。根据Golbert L等［18］的研究，较高的血清TSH水平与TC风险增加相关，将TSH水平作为甲状腺恶性肿瘤风险分层的辅助诊断指标可能有助于确定最佳的治疗方法。有研究发现，TgAb、TPOAb对恶性甲状腺结节的检出率分别为63.64%、62.63%［19］。本研究在PTC患者中发现了较高的TPOAb和TgAb水平，但分析结果显示两组之间差异无统计学意义，这一结果可能与样本量的大小及样本的入选条件有关，有待进一步研究。根据《2022年甲状腺癌诊疗指南》，TC的肿瘤标志物有Tg、CT、CEA。Tg在鉴别甲状腺结节良恶性方面缺乏特异性，但血清Tg变化可作为判别肿瘤复发和转移的重要指标。血清中CT和CEA水平变化有助于髓样癌患者评估疗效以及病情监测。甲状腺结节的超声恶性征象有纵横比≥1、边界不清晰、实性低回声结节、有微小钙化、甲状腺外侵犯等。超声TI-RADS分级是术前筛查及诊断甲状腺结节的重要手段之一，TI-RADS分级越高，恶性的概率越大。在本研究中，PTC组中纵横比≥1、边界不清晰、包膜受侵犯、TI-RADS分级≥4级的患者的比例明显高于BTN组。但是，甲状腺超声只能初筛甲状腺结节的良恶性，不能明确诊断，且准确度受医师经验的影响。

miRNA对肿瘤的发生、发展有很大的影响，它可以精确地与mRNA结合，在转录或转录后水平调控靶基因的表达［20］。miRNA具有几个潜在的优势，包括易于PCR检测、相对同质性和高度特异性的表达。研究表明，miRNA在人体内具有组织特异性，有些癌症会高水平表达miRNA，而有些癌症则会低水平表达。miRNA150-5p在胃癌、宫颈癌、非小细胞癌中高表达［21-23］，在头颈部鳞癌、结直肠癌、胰腺癌中低表达［24-26］。在本研究中，笔者使用qRT-PCR检测了PTC组织、癌旁组织及BTN组织标本中miRNA150-5p的表达水平。本研究数据显示，与配对癌旁组织和BTN组织相比，miRNA150-5p在PTC组织中的表达明显降低。为了进一步验证这一结果，通过分析从TCGA RNA-Seq数据库获得的514例PTC组织及59例正常甲状腺组织基因表达数据集，发现PTC组织中miRNA150-5p的表达量显著低于正常组织。

鉴于miRNA150-5p在PTC中的表达显著较低，笔者进一步研究了miRNA150-5p表达与PTC之间的关系。在多因素logistic回归方程中纳入miRNA150-5p表达量、年龄、TSH、纵横比≥1、边界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分级≥4级等变量，miRNA150-5p表达量仍是PTC的一个重要影响因素，miRNA150-5p表达量越高，发生PTC的风险越小，表明它可能对PTC的发生至关重要。miRNA150-5p通过靶向基质金属蛋白酶14（MMP14）抑制肝癌细胞迁移和侵袭［27］。miRNA150-5p通过抑制TP53抑癌基因促进结肠腺癌增殖［28］。miRNA150-5p在宫颈癌细胞中高表达，通过靶向SRCIN1促进上皮间充质转化（EMT）和癌细胞的增殖［22］。miRNA150-5p通过靶向Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖［29］。然而，miRNA150-5p影响PTC发生的具体机制尚不清楚，未来需要更多的研究。

近年来，遗传检测已成为发展迅速的方法之一，其诊断用途日益增加。miRNA是一种有前途的诊断工具，将miRNA引入PTC诊断程序将提高良性和潜在恶性病变的区分。更详细地了解PTC发生过程中miRNA的作用机制可能会发现新的潜在医学靶点，这对于肿瘤的临床管理尤其重要。笔者利用ROC分析了miRNA150-5p预测诊断PTC的价值：miRNA150-5p的AUC为0.797，特异度、灵敏度和准确度分别为89.47%、67.44%和74.19%；因此，推测其可作为PTC潜在的诊断标志物。miRNA在甲状腺结节鉴别诊断中的作用已有研究，利用ROC分析miRNA223-5p、miRNA16-2-3p、miRNA152-3p、miRNA34a-5p、miRNA31-5p对甲状腺癌的诊断价值，其AUC分别为0.720、0.690、0.630、0.604、0.580［30-31］。可以看出，单个miRNA的诊断价值有限；因此，可以将更多的miRNAs联合应用于PTC的诊断，提高术前PTC诊断的准确度。

综上所述，miRNA150-5p在PTC组织中显著低表达，miRNA150-5p在区分PTC患者和BTN患者方面具有良好的诊断性能，有望成为诊断PTC的潜在生物标志物。因此，在临床实践中，miRNA可以被认为是一种新的、有前途的、微创的PTC诊断工具。为了进一步验证miRNA在PTC检测中的准确性，未来还需要对更大的样本进行更多的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突