不同干燥时长对小麦成熟胚愈伤组织再生进程的影响
2023-09-20沈跃鹏赵国建赵鹏飞金建猛赵国轩
沈跃鹏 赵国建 赵鹏飞 金建猛 赵国轩
（开封市农林科学研究院 河南开封 475004）
小麦作为我国主要的粮食作物，它的组织培养和细胞培养对促进小麦生产科学发展和产量提高有着重要作用。 尤其是在突变体的筛选和移植方面，愈伤组织和细胞根再生能力对能否建立一个高效、成功的植株培养体系至关重要。 由于基因型和不适宜环境条件等的影响，不是所有的品种都容易再生，有关小麦成熟胚组织培养的报道很多，不同的小麦品种在愈伤组织形成、体细胞形成和根再生效率方面有明显的不同。 如何克服基因型的限制，扩大材料范围，建立良好的培养体系是开展小麦组织培养工作的基础[1]。 愈伤组织干燥处理曾用于大豆[2]、水稻[3]，以促进其体细胞胚的发育，之后这一方法又用于籼稻，使其再生频率有了很大的提高[4]，但在小麦成熟胚中相关应用研究较少。 为了建立小麦稳定高效的再生体系，笔者针对小麦成熟胚愈伤组织设计了不同干燥时长处理，对愈伤组织的干燥率、吸胀率和再生率进行了研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验将开麦18、 开麦20、 开麦22 和开麦1502等4 个小麦品种的成熟胚愈伤组织经过15 周继代培养后，进行植株再生。
1.2 试验培养基
诱导培养基：MS+2 mg/L 2,4-D+500 mg/L 脯氨酸+500 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖。
分化培养基：MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L KT+500 mg/L 脯氨酸+500 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖。
1.3 试验方法
1.3.1 接种 2022 年6 月15 日开始接种。取收获后的开麦18、开麦20、开麦22 和开麦1502 等4 个品种大小一致的种子用75%乙醇浸泡3～5 min 后，用无菌水冲洗3～4 次，0.1%的HgCl2灭菌10～15 min，再用无菌水冲洗3～4 次， 然后放入30℃左右的无菌水中浸泡3～5 h。 浸泡后用灭菌过的解剖刀从籽粒中上部剥出胚，盾片向上置于诱导培养基上，每个培养皿接种20 个胚。
1.3.2 继代培养 接种后， 愈伤组织每3 周继代一次，连续继代15 周。 继代培养基与诱导培养基的成分相同。 将继代的愈伤组织放在26℃的培养箱进行暗培养。
1.3.3 干燥率和吸胀率的计算 继代培养15 周后，参照Amstrong[5]的标准挑选出Ⅰ型愈伤组织,在无菌条件下转移到铺有4 层中性滤纸的空培养皿中,在26℃的培养箱中分别干燥6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，并记为D6、D12、D24、D48、D72， 每个品种设置3 次重复。计算愈伤组织干燥率。
将干燥处理的愈伤组织及未干燥处理的愈伤组织（D0）分别转移到诱导培养基中。 愈伤组织诱导培养的温度为26℃， 光周期为16 h 光照、8 h 黑暗，光照度为3 500 lx[6]。 在诱导培养基中培养48 h 后称量愈伤组织的质量，并计算愈伤组织吸胀率。
1.3.4 植株再生率的计算 将干燥处理的愈伤组织和未干燥的愈伤组织（D0）转移到分化培养基中进行培养，培养温度为26℃，光周期为16 h 光照、8 h 黑暗，光照度为3 500 lx。 培养1 周、2 周、3 周、4 周、5 周后,分别记载2 cm 长健壮根的质量、数量,计算植株再生率。
1.3.5 数据分析与图表绘制 数据分析和图表绘制利用Excel 2010 统计软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 不同干燥时长对小麦成熟胚愈伤组织干燥率的影响
由图1、表1、表2、表3 可以看出，随着干燥时间的延长，4 个品种的干燥率呈现逐渐增长的趋势，其中从D0～D6干燥率呈现快速增长的趋势， 均增长了13.57%，D6～D12干燥率的增长相对比较缓慢，只增加了0.71%，当干燥时间超过12 h 以后，干燥率的增长又呈现上升的趋势， 并且随着干燥时间的延长增长加快，其平均干燥率为20.7%，干燥时长和品种间的互作达极显著水平；4 个品种间的干燥程度也有明显的不同，以开麦1502 干燥率最高，其平均干燥率为22.32%，品种间干燥率差异达显著水平。
表1 不同品种和干燥时长干燥率比较
表2 各干燥处理干燥率方差分析
表3 各干燥处理的吸胀率和干燥率比较
图1 不同干燥时长对愈伤组织干燥率的影响
2.2 不同干燥时长对小麦成熟胚愈伤组织吸胀率的影响
由图2、表3、表4 可知，品种和干燥处理时间的互作达极显著水平，品种间吸胀率的差异不显著。 干燥时间越长，在继代培养基中的吸胀率就越高。 干燥6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 处理， 吸胀率分别是未干燥处理的1.10 倍、1.25 倍、1.48 倍、1.60 倍、2.44 倍，与未干燥处理（D0）相比，其吸胀率增加比较显著。 4 个品种在继代培养基中吸胀率均随着干燥时间的延长而逐渐增加，以开麦1502 愈伤组织吸胀率最高。 愈伤组织未加干燥的处理即D0～D6的吸胀率表现出显著增长趋势； 干燥时间为6～12 h 的各处理吸胀率增加较缓慢；而干燥时间为48～72 h 的各处理品种吸胀率又呈迅速增长趋势。
表4 各干燥处理吸胀率方差分析
图2 不同干燥时长对愈伤组织吸胀率的影响
2.3 不同干燥时长对小麦成熟胚愈伤组织再生率的影响
对4 个品种小麦成熟胚愈伤组织进行不同程度的吸湿干燥处理， 并对前5 周的再生频率进行统计（表5）。 结果表明，愈伤组织再生率随着干燥时间的增加而提高， 但是干燥处理72 h 时再生率下降，而4 个品种最高的再生率均是在干燥48 h 时， 以开麦1502 再生率最高，达21.63%。
表5 干燥处理对再生频率的影响（单位：%）
对于同一品种的干燥处理， 从第1 周到第4 周再生率逐渐增加， 在第4 周再生率达到最高， 在第5 周再生率下降。 对于不同时长的干燥处理，培养周数相同时，除72 h 以外，各品种都随着干燥时长的增加再生率逐渐增加，在干燥处理48 h 时再生率最高，而在第5 周时随着干燥时间的增加再生率下降。 由此可见，干燥处理48 h 时再生率最高。
3 讨论与结论
本文作者将4 个小麦品种的成熟胚愈伤组织在吸湿干燥处理后进行植株再生和直接进行植株再生，试验表明，在分化前对小麦愈伤组织进行吸湿干燥处理，可以普遍提高愈伤组织的再生率，加快再生进程，这与田文忠[7]在水稻上的试验结果一致。 这是因为处理降低了愈伤组织的2,4-D 质量浓度和含水量，造成愈伤组织饥饿，愈伤组织一旦转入分化培养基就能更快地吸收养分和6-BA、KT，促进生芽。 这一方法对提高植株再生率， 克服一些植物离体培养再生植株困难有实用价值， 并对离体筛选有益突变体和转基因研究具有特别意义。
加快愈伤组织植株再生速度，缩短植株分化时间，对获取健壮的试管幼苗极其重要。 本试验表明， 愈伤组织经过吸湿干燥处理可以普遍增加分化前期再生植株的比例，加快再生进程。 吸湿干燥处理优于直接分化处理， 这与吸湿干燥处理能更好地降低愈伤组织2,4-D 含量有关， 而且处理造成的渗透压变化，加快了激素6-BA、KT 渗入愈伤组织细胞，促进了芽分化。 不同品种的愈伤组织吸湿干燥处理后在苗分化率和分化速度上存在一定差异， 这可能与不同品种愈伤组织的状态和含水量不同有关。
