不同冷冻胁迫时间对茶鲜叶中酶活性和营养成分的影响

2023-09-20牛小军黄海涛李红莉敖存

中国茶叶 2023年9期

牛小军黄海涛李红莉敖存

摘要：为探究“倒春寒”和模拟冻害条件下茶树鲜叶中酶活性与营养成分的变化，以“倒春寒”发生时茶树实际受冻害和模拟冻害的新梢为研究材料，比较了不同冷冻胁迫时间下茶树鲜叶中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）酶活性及营养成分变化的差异。结果表明，在－3～－5 ℃冷冻4～6 h的条件下，模拟冻害的鲜叶外形最接近实际受冻情况。随着冷冻时间的增加，鲜叶中PPO酶活性呈现先升高后降低趋势，POD酶活性整体趋于稳定，而β-GC酶的活性整体呈现降低趋势。此外，在冷冻过程中鲜叶茶黄素含量显著增加，酯型儿茶素含量显著降低。这些研究可为茶树遭受冻害时鲜叶质量评估与再利用，以及茶树响应“倒春寒”机制研究提供一定理论依据。

关键词：茶树；倒春寒；冻害；鲜叶品质；酶活性

中图分类号：S571.1；Q946.5 文献标识码：A 文章编号：1000－3150（2023）09-37-6

Effects of Different Freezing Stress Times on the Enzymatic

Activities and Nutritional Compositions in New Tea Shoots

NIU Xiaojun， HUANG Haitao， LI Hongli， AO Cun*

Hangzhou Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310024， China

Abstract： To investigate the changes in enzyme activities and nutritional components in fresh tea leaves during the occurrence of "late spring cold" and under simulated freezing injury conditions， new shoots of freezing injury and simulated freezing injury were used in this study as materials. The activities of PPO， POD， β-GC and nutritional compositions of new shoots were compared under different freezing conditions. The results show that under the condition of freezing at -3 ℃ to -5 ℃ for 4-6 hours， the phenotypes of simulated frozen fresh leaves were closest to the actual freezing situation. As the freezing time increases， the activity of PPO increased firstly and then decreased， while the activity of β-GC shows a decreasing trend， and the activity of POD enzyme tends to stabilize. In addition， the content of theaflavins shows a significant increase， while the content of ester catechins significantly decreased. This study provided theoretical guidance for the quality evaluation of fresh leaves when tea trees suffer from freezing injury and laid a foundation of the mechanism of tea trees responding to "late spring cold".

Keywords： tea plant， late spring cold， freezing injury， quality of the fresh leaf， enzymatic activity

初春茶樹新梢萌动后如遭受“倒春寒”天气，会造成茶树幼嫩新梢受冻褐变，甚至焦枯坏死[1]。从而导致茶叶品质下降，产量锐减，严重时甚至绝收，给茶叶生产造成巨大的经济损失。当前浙江省茶树主栽品种中，早生与特早生品种占较大比例，然而这些品种抗寒性相对较差，极易遭受“倒春寒”危害。目前“倒春寒”已成为对茶叶生产影响最大的气象灾害之一[2]。

生产上针对“倒春寒”引起的低温冻害已逐级形成了较为完善的技术措施，如稻草覆盖、烟熏驱霜、深耕施肥、加装防霜风扇、剪除受冻枝条等 [3]。近些年，关于调控茶树新梢响应低温的分子机理研究也取得了很多新进展[4-5]。然而，关于茶树新梢在遭受“倒春寒”后鲜叶的生理变化及质量评价还鲜有报道。本研究以“倒春寒”发生时茶树鲜叶实际受冻害和未受冻害的新梢为研究材料，比较不同冷冻时间胁迫下茶树鲜叶中过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）的酶活性及营养成分变化的差异，以期为茶树遭受冻害时鲜叶质量评估及响应“倒春寒”机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为茶树无性系品种龙井43，实际受冻茶鲜叶嫩度以一芽一叶为主，于2021年3月25日采自杭州市农业科学研究院茶叶研究所瓶窑基地。模拟冻害试验原料嫩度为一芽一叶至一芽二叶，于2021年3月30日采自杭州市农业科学研究院茶叶研究所大清谷基地，鲜叶进厂后，均匀扦取每份600 g，以3 cm厚度铺于冰柜中，－3 ～－5 ℃（模拟实际受冻温度）分别冷冻2、4、6、8、10 h。

1.2 试剂耗材与仪器

1.2.1 试剂耗材

谷氨酸、茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、没食子酸、碳酸钠、福林酚（分析纯）、冰乙酸、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙腈（色谱纯）、咖啡碱、儿茶素标样（Sigma-Aldrich）、蒸馏水、β-葡萄糖苷酶试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、多酚氧化酶试剂盒和过氧化物酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.2.2 设备与仪器

万分之一天平（Sartorius BSA224S）、DK-S28电热恒温水浴锅（上海精宏）、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱、－80 ℃超低温冰箱（海尔 DW-86L626）、冷冻离心机（Centrifuge Velocity 18R Pro）、色差仪（Hunter Lab Color Quest XE）、液相色谱仪（Waters 2695-2998）、TU-1901分光光度计（北京普析）等。

1.3 试验方法

1.3.1 冻害发生时环境温度測定

温度计位于离地面1 m高接近茶树蓬面的位置，采用温度自动记录仪记录每小时温度变化。

1.3.2 鲜叶固样

采用五点取样法扦取茶青100 g放入液氮中迅速冷冻10 min，然后于－80 ℃超低温冰箱冷冻保存，用于酶活性测定。

1.3.3 生化样制作

生化样制作参照曾贞等[6]的微波固样法并做适当调整，取不同冷冻条件下的茶青500 g，1～2 cm平铺于微波炉中，高火微波杀青2 min，取出冷却散失水汽后，中火微波1 min，最后60 ℃烘至足干（45～60 min），用于理化分析和色差分析。

1.3.4 冻害分级及冻害指数测定

茶树新梢受冻程度分级标准参照童启庆[7]冻害分级标准略有修改。以新梢的芽头和第一叶的受冻面积比例为判断标准，定义受冻面积＜5%为0级，5%～32%为1级，33%～65%为2级，≥66%为3级。取茶青20 g，目测各个新梢进行分级，称量各级样品的质量。根据质量计算出各级受冻鲜叶比例，并计算出冻害指数（冻害指数=∑冻害等级×该等级所占比例），重复3次。

1.3.5 酶活性测定

PPO：取茶样1.0 g放入加有少许石英砂的研钵，加入5 mL提取液，进行冰浴匀浆；然后在8 000 r/min转速下离心10 min。取上清液150 μL，在37 ℃ 恒温水浴保温 10 min，取出后立即转入90 ℃以上沸水浴加热5 min，取出后流水冷却，在10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液于波长420 mm处，用1 cm光径比色皿，蒸馏水调零后测定各管吸光度（ΔA=A测定－A对照）。具体参照PPO测试盒说明书（南京建成生物工程研究所）。

POD：取茶样1.0 g放入加有少许石英砂的研钵，加入9 mL预冷的磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.0～7.4）后，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆，在3 500 r/min离心10 min。取上述上清液0.1 mL按照试剂盒中的配方混匀后，3 500 r/min离心10 min。取上清液于420 nm处，用1 cm光径比色皿，蒸馏水调零后测定各管吸光度OD 值。具体参照POD测试盒说明书（南京建成生物工程研究所）。

β-GC：取茶样1.0 g放入加有少许石英砂的研钵，加入5 mL预冷提取液，冰浴匀浆，然后在15 000 r/min转速下离心20 min。取上述上清液0.1 mL按照试剂盒中的配方混匀后，在37 ℃水浴中保温30 min后，立即在沸水浴中煮沸5 min，流水冷却后充分混匀。室温静置2 min后，于400 nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定－A对照。具体参照β-GC检测试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3.6 理化成分检测

水分含量参照《食品安全国家标准食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）、游离氨基酸总量参照《茶游离氨基酸总量的测定》（GB/T 8314—2013）、茶多酚含量参照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313—2018）、水浸出物含量参照《茶水浸出物测定》（GB/T 8305—2013）测定。儿茶素组成和咖啡碱测定采用液相色谱法，具体方法参照文献[8]。茶色素测定采用系统分析法，具体参照文献[9]。

1.3.7 色差值测定

称取3.0 g茶样置于审评杯中，注满沸水，5 min后用滤纸滤出茶汤至250 mL锥形瓶中。用总透射法测定茶汤色差，以纯净水作为对照，用厚度为1 cm的比色皿测定茶汤明暗度（L）、红绿色度（a）、黄蓝色度（b）。由 L、a、b值计算颜色的系列衍生指标，以 a2+b2 为色调彩度（Cab），以 Cab/L 为色彩饱和度（Sab），以b/a 为色相 [10]。重复3次。

1.4 数据统计分析

利用Excle 2019及SAS 9.4统计软件进行统计分析，使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 茶园冻害发生时环境温度及模拟冻害下鲜叶变化

2016年和2020年两次倒春寒发生时对受冻茶园实际温度进行了监测记录，结果表明，冻害发生时，茶园蓬面高度的气温在夜晚20：00下降至0 ℃以下，至清晨6：00时降至最低，分别达到－4.2 ℃和－6.8 ℃，然后随着日出，气温逐渐回升至0 ℃以上（图1）。因此，模拟受冻试验将温度设定为－3～－5 ℃开展，鲜叶受冻程度分为4个等级，如图2。随着冷冻时间的增加，叶色由鲜绿逐渐变红，且红变比例逐级上升。试验结果显示随着冷冻时间的增加，冻害0级的比例逐渐下降，冻害3级的比例逐渐上升，冻害1级和2级的比例趋于稳定。冻害指数随着冷冻时间的延长，表现为逐渐增大。与模拟冻害相比，实际鲜叶受冻指数位于冷冻4～6 h之间，且实际受冻鲜叶中，冻害0级和1级占比最多，2级和3级占比较少。

2.2 酶活性的变化

不同冷冻条件下鲜叶中PPO、POD及β-GC酶活性的变化如图3。随着冷冻时间的延长，冷冻鲜叶POD活性整体趋于稳定；PPO活性先升高后降低，实际受冻鲜叶PPO活性最低；而β-GC的活性整体呈现降低趋势，实际受冻鲜叶该酶活性亦是最低。

2.3 茶色素含量的变化

分析不同冷冻条件下鲜叶的茶色素成分含量（图4）发现，鲜叶在冷冻后茶色素含量整体呈现增加的趋势。其中，随着冷冻时间的延长，鲜叶中茶褐素和茶红素含量增加趋势较缓，且在冷冻8 h后均基本不再增加（图4-A）；鲜叶中茶黄素含量逐渐增加，且不同处理时间的鲜叶中茶黄素含量均有显著差异（图4-B）。实际受冻鲜叶中茶色素含量均低于冷冻胁迫鲜叶中的含量。

2.4 理化成分分析

鲜叶冷冻处理后，其理化成分如表1。与未冷冻处理（冷冻0 h）的鲜叶相比，冷冻处理后鲜叶中氨基酸含量无显著变化；实冻鲜叶中氨基酸含量显著高于不同冷冻处理鲜叶；冷冻后茶多酚、水浸出物及咖啡碱含量整体呈现下降趋势，并以实冻鲜叶含量最低。此外，冷冻处理后鲜叶中儿茶素总量与未冷冻鲜叶相比呈显著下降，且随着冷冻时间的延长，呈逐渐下降趋势。从儿茶素组分含量上看（表2），经冷冻处理后鲜叶中儿茶素各组分含量均明显下降，且随着冷冻时间的延长，不同类型的儿茶素含量大部分呈逐渐下降趋势。在冷冻2 h后，没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）和表儿茶素（EC）含量分别下降5.8%、5.0%、6.8%、4.8%，而表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和儿茶素没食子酸酯（CG）则分别下降10.2%、15.4%、8.6%、14.3%。可见冷冻处理对酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）的影响明显大于对非酯型儿茶素（GC、EGC、C、EC）的影响。

2.5 茶汤色差分析

不同冷冻处理鲜叶所制的茶样冲泡后茶汤色差测定结果见表3。鲜叶冷冻后制得茶样的汤色随着冷冻时间的延长，L值逐渐降低，表示亮度逐渐降低；a在负值表示绿色程度，b在正值表示黄色程度，由表3可见，随着冷冻时间的延长，茶汤绿色度和黄色度逐渐增加，导致汤色表现为黄绿，且不同冷冻处理之间存在显著差异。实际受冻鲜叶所制茶样的汤色从肉眼观察和色差数值上看均比较接近模拟冷冻4 h左右鲜叶所制茶样的汤色。

3 小结与讨论

低温霜冻是影响春季茶芽生长的最重要环境因子，本研究以“倒春寒”发生时茶树鲜叶实际受冻害和模拟冻害的新梢为材料，研究发现在－3～－5 ℃冷冻4～6 h的条件下，模拟冻害鲜叶外形最接近实际受冻情况；同时比较了不同冷冻胁迫时间下茶树鲜叶中酶活性、茶色素及理化成分变化的差异，为茶树遭受冻害时鲜叶质量评估与再利用，以及响应“倒春寒”机制研究提供理论依据。

鲜叶冻伤后叶片细胞的原生质膜及部分细胞器遭受损伤，细胞膜透性增加。解冻过程中叶片细胞内的部分物质不受限制地从胞內流到胞外，引起一些多酚类物质被氧化，产生一定发酵作用导致部分鲜叶红茎红叶，甚至焦枯[11]。王舒婷等[12]采用冷冻干燥和真空干燥工艺对冻害鲜叶加工工艺进行优化，所制绿茶色泽翠绿，香气、滋味及汤色都得到极大改善，表明冻伤的鲜叶经过合理的加工也可以适制绿茶。张丽霞等[13]依据霜冻芽叶色泽的类型和匀度分别进行分类后，采用不同的加工工艺将冻害鲜叶加工成白茶或红茶，一定程度避免了“倒春寒”造成的茶园经济损失。

本研究中，鲜叶冻伤后其儿茶素含量急剧减少，茶色素含量增加，但氨基酸、咖啡碱等变化较小。从外形上看，红变后的鲜叶显然已不适合制作高档绿茶，但还没有完全枯焦的茶芽可抢采后加工制成低档绿茶或新式茶饮的原料茶。此外，鲜叶冻伤后茶黄素含量显著提升，茶黄素是红茶重要的品质成分之一，与红茶的汤色、滋味高度正相关 [14-15]。侯炳豪等[16]研究发现经过冷冻处理的萎凋叶后期在制作工夫红茶中可以显著提高红茶中茶黄素含量，并改善茶叶品质。黄建琴等[17]研究认为鲜叶冷冻萎凋过程中茶黄素的含量相比自然萎凋显著增加，且能改善红茶的汤色和滋味品质。本研究中随着冷冻时间的延长，鲜叶中茶黄素的含量亦呈现显著增加，可能是由于鲜叶冷冻后细胞膜透性增加，解冻后细胞中儿茶素等多酚类化合物与多酚氧化酶迅速接触，进一步催化为茶黄素。冻害后的鲜叶本质上是进行了低温冷冻萎凋，因此可通过合理的工艺技术将其加工为优质红茶，从而减轻因“倒春寒”带来的损失。

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