薄膜过滤法在抗生素类注射剂无菌检查中常见问题及分析

2023-09-19简秋瑜袁海梅

生物化工 2023年4期

简秋瑜，袁海梅

（1.云南省食品药品审核查验中心，云南昆明 650000；2.楚雄州检验检测认证院,云南楚雄 675000）

抗生素类注射剂在一定程度上可抑制微生物生长和繁殖，但在用常规方法对其进行无菌检查时容易出现假阴性结果。按照2020 年版《中华人民共和国药典》规定[1]，只要供试品性状允许，包括能直接过滤或者经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。选用薄膜过滤法检测抗生素类注射剂，可将药物抗微生物物质去除，细菌等其他微生物则会遗留在过滤器，对其培养促使生长和繁殖，以此定性或定量检测微生物[2]。由于不同类别抗生素类注射剂的抗菌活性、抗菌谱不同，在对抗生素类注射剂用薄膜过滤法消除其抑菌作用而进行无菌检查的过程中，笔者通过多年从事的微生物检验工作经验，归纳总结容易遇到的问题，为相关从业人员提供借鉴。

1 常见问题及分析

1.1 供试品溶解不彻底

抗生素类固体注射剂（如密封瓶粉针剂）无菌检查时需要溶解、转移、稀释后再采用薄膜过滤法过滤，在溶解稀释的过程中，溶剂和稀释液的种类、比例和振荡器的使用等因素都会直接影响到供试品的溶解过滤效果。2020 年版《中华人民共和国药典》四部无菌检查法中收载的稀释液有0.1%无菌蛋白胨水溶液、pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，试验研究结果表明，用前两种溶液做稀释剂，其微生物的回收率远高于0.9%的无菌氯化钠溶液[3]。此外，笔者在注射用派啦西林钠他唑巴坦钠无菌检查工作中，按索要到的方法进行无菌检查，发现阳性对照菌在规定条件下未能生长，无菌试验结果无效。经原因排查，证实是供试液溶解不彻底，过滤时滤膜吸附了大量供试品，被滤膜吸附的供试品虽经反复冲洗仍不能去除干净，残留在滤膜上的供试品导致阳性菌不能在规定的条件下生长。后从厂家了解到，检验人员在对注射用派啦西林钠他唑巴坦钠进行无菌检查时，使用了促进供试品溶解的振荡仪，但在所提供的无菌检查方法中并未记录振荡操作的相关信息，从而导致监督抽检中无菌检查项目实验不成立。

1.2 集菌培养器选择不当

为了避免操作过程带来的人为污染和人为偏差，大部分实验室会优先选择用一次性全封闭集菌培养器对抗生素类注射剂的供试品溶液进行过滤。全封闭集菌培养器的滤膜材质、孔径及其与检品的相容性是影响试验结果的关键因素。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分截留效果，即抗生素类注射剂具有抑菌性，在过滤时易被滤膜吸附，须采用疏水性边缘及低吸附的滤膜，如可选用尼龙膜材质的集菌器。无菌检查用的薄膜过滤器的滤膜孔径应不大于0.45 μm，该孔径滤膜能有效截留微生物，滤膜直径为50 mm[3]。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损。

目前市面上销售的一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号、规格众多，适用的产品类型也不相同。如A 企业生产的集菌培养器：安瓿瓶装抑菌性药液可选用加长型取样针，无需将样品额外转移，可快速转移检品；西林瓶装抑菌性粉剂可选用双针座设计，提供全封闭溶解方案，实现溶解、过滤、冲洗一体化操作，避免转移操作；需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂可选用三针座设计，溶解、稀释、过滤、冲洗一体化操作，降低抑菌成分浓度，减少吸附。检验人员在选择集菌培养器时，要结合产品溶解度、抑菌程度等以达到预期的过滤效果，选择不当会增加冲洗液的用量并影响检验结果的可靠性。

1.3 冲洗方法不具体

抗生素类注射剂中有的品种抑菌作用较强，供试液过滤后还需要通过冲洗液冲洗才能消除其抑菌作用。笔者在长期抗生素类注射剂无菌检查工作中发现，索要到的一些无菌方法验证报告中试验操作过程过于简单，只是列出冲洗量和冲洗次数，冲洗量得出的过程并没有详细记录，也没有注明冲洗时的流速。如克林霉素注射液无菌检查方法验证结果报告中记录的冲洗操作方法和实际操作中使用的方法不完全一致（表1）。从表1 中可以看出，方法验证报告中冲洗方法描述比较简单，许多需要注意的操作细节在方法验证报告中并没有记录。且在大部分验证报告中冲洗时的流速均没有注明，而流速过快或过慢都会对实验结果造成一定的影响，如过慢的冲洗流速不能把抑菌成分冲洗干净，消除不了供试品的抑菌作用，而过快的冲洗流速会损伤微生物，从而导致检验结果不能反映供试品真实的无菌状态[4]。

表1 克林霉素注射液方法验证报告中的冲洗方法和实际试验冲洗方法对比

1.4 培养基储存不当

对于适用性检查合格的培养基，储存不当会导致质量降低甚至不合格，影响无菌试验的结果。如无菌检查中最常用的硫乙醇酸盐流体培养基，可以在普通有氧环境下提供厌氧条件，使需氧菌和厌氧菌都能够生长良好，并易于观察结果[5]。2020 年版《中华人民共和国药典》四部规定，在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3，培养结束后，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/2。对培养基有要求，是为了确保培养基的厌氧层能够满足厌氧菌生长条件的需要[6]。培养基氧化层的高度多少，取决于培养基的储存条件。不同的实验室对配制好的无菌检查用培养基会有不同的储存方式，如有的实验室用量较大，大批量配制后采用无菌灌装，并在容器内填充氮气，压盖，2 ～25 ℃储存；有的实验室用量不大，可用硅胶塞及纱布包裹瓶口灭菌后，2 ～8 ℃避光保存。无论采用什么条件储存，都应该进行相关的验证，以确定合理的保存条件，保证培养基的质量符合要求。

1.5 酶的活性降低

在抗生素类注射剂无菌检查中，除了采用薄膜过滤法消除其抑菌作用外，针对一些抗菌作用比较强的β-内酰胺类抗生素类注射剂，还可以加入中和剂β-内酰胺酶，两种方法联合使用可有效消除供试品的抑菌活性。供试品过滤、冲洗完成后，在加入培养基的集菌器中加入中和剂β-内酰胺酶，使通过冲洗不能完全冲洗干净、吸附于滤膜的少量供试品失去活性。β-内酰胺酶的使用，可以减少冲洗液的冲洗总量和冲洗次数，避免滤膜上的微生物受损坏。β-内酰胺酶的储存条件为2 ～8 ℃，储存温度的不同，酶的活力也会受到不同影响。实验室在使用此类酶的过程中，要严格按照产品的要求储存，注意储存温度和储存时间对酶活性的影响。储存不当，酶的活性降低，若始终按标示的酶活性计算加入的量，加入的酶无法彻底消除供试品的抗菌作用。

1.6 阳性对照菌未按要求加入规定量

2020 年版《中华人民共和国药典》规定应根据供试品的特性选择阳性对照菌，阳性对照实验的菌液制备同方法适用性实验，加菌量不大于100 cfu[1]。笔者在监督抽检中发现，有的厂家为了节约成本，检验人员用新鲜液体培养基制备好菌液，检测一次菌液的含菌量，符合要求后就储藏于4 ℃冰箱多次使用，而在后面的使用中均按第一次的使用量加入，并没有每次使用时都检测所加入菌液量是否在规定范围内，导致企业在进行验证时实际加入的阳性对照菌量多于规定量甚至是规定量的几倍，阳性菌在规定培养条件下生长良好，出现了实验成立的假象。