人参茎叶中人参皂甙含量检测前处理工艺优化及方法学考察

杨景霞，刘凯华，毛华，张良明，杨阳

（西安天一生物技术股份有限公司，陕西西安 710000）

人参（Panax ginsengC.A.Mey.）为五加科植物的干燥根及根茎[1]。《神农本草经》记述人参具有主补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目益智，久服轻身延年的功效[2]。人参的主要活性成分为人参皂甙，广泛分布于人参各个部位[3]。迄今为止，人们已从人参中分离鉴定出40 余种人参皂苷单体，人参皂苷属于三萜类皂苷[4]。人参茎叶为人参的地上部分，为了充分利用人参资源，人们对人参的研究已拓展到茎叶部分。研究表明，人参茎叶皂苷不仅具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、保肝护心、提高免疫、促进细胞增殖等功效，在缓解疲劳方面也起到一定的作用[4-6]。

人参茎叶原料质量来源不一，对原料的验收标准较为模糊。一方面药典中原料的检测方法主要针对人参叶中人参皂甙Rg1 与人参皂甙Re，原料的前处理比较复杂，用时较长；但人参茎中也含有人参皂甙，在大生产中，会对茎和叶整柱利用，而不会仅利用叶子。另一方面由于采用药典中检测人参叶的方法对人参茎叶中皂甙含量进行检测的结果偏低，一般Rg1+Re 含量不超过1.2%，与生产的最终产品转移率不对应。因此，认为采用药典中检测人参叶中皂甙含量的方法不适用于人参茎叶整柱的检测。

结合药典中人参茎叶提取物及市场对人参茎叶提取物的活性成分要求（Rg1、Re、Rd 的总量应为30%～45%），本研究以这3 种活性成分总和为标准，采用正交实验进行原料前处理条件的优化，确定人参茎叶原料的检测方法并研究其方法的可靠性、准确性，为人参茎叶原料中人参皂苷的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；SQP 十万分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；KQ-600DV 台式数控超声波清洗器，昆山市禾创超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

人参茎叶，采摘自吉林省白山市抚松县，经西安天一生物技术有限公司质量部显微鉴定为五加科植物人参的干燥叶。人参皂甙Rg1 对照品（110703—202034）、人参皂甙Re 对照品（110754—202129）、人参皂甙Rd 对照品（111818—202104），中国食品药品检定研究院；甲醇，色谱纯，德国MERCK公司；乙腈，色谱纯，德国MERCK 公司；磷酸，分析纯，天津科市恒兴试剂制造有限公司；甲醇，分析纯，天津科密欧公司；氧化镁，分析纯，福晨天津化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液制备

（1）混合对照品溶液的制备：精密称定人参皂苷Rg1（94%）对照品16.02 mg、人参皂苷Re（96%）对照品24.37 mg 和人参皂苷Rd（97.3%）对照品10.33 mg，加甲醇溶解后，定容于50 mL 的容量瓶，制成混合对照品溶液。

（2）供试品溶液制备：取5 g 粉碎后过40 目筛的人参茎叶原料置250 mL三角瓶中，加0.10 g氧化镁，再加入约200 mL 自来水，60 ℃超声提取1.5 h，提取结束后放凉，提取液过滤至250 mL 容量瓶中。提取渣用水洗，定容至250 mL 容量瓶，摇匀，即得。

1.3.2 色谱条件与系统适用性条件

色谱柱：Agilent Extend C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱（0 ～30 min，流动相A 19%，流动相B 81%；30 ～35 min，流动相A 19%—24%，流动相B 81%—76%；35 ～60 min，流动相A 24%—40%，流动相B 76%—60%）；柱温30 ℃；流速1.3 mL/min；检测波长203 nm；理论塔板数按人参皂甙Rg1 峰计算应不低于6 000[1]。此条件下人参茎叶供试品中各组分峰形较好，共存成分不干扰人参皂甙的检测，所得高效液相色谱图见图1。

图1 标准品与样品色谱图

1.3.3 人参总皂甙含量的测定

在1.3.2 色谱条件下，待仪器稳定基线平稳后，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。用外标法计算样品中人参总皂甙的含量。

1.4 方法学考察

1.4.1 人参茎叶原料前处理条件优化实验

在前期单因素实验的基础上，以氧化镁加入量、原料粉碎粒度、提取温度、超声时间为考察因素，每个因素各取3 个水平，以人参总皂甙为考察指标，设计正交实验因素水平表，见表1。

表1 因素水平表

1.4.2 人参茎叶原料中总皂甙最佳提取工艺验证实验

根据正交实验确定的最佳提取工艺，进行三批次验证，通过1.3.2 项下方法测定人参总皂甙含量，以确保该条件为最佳提取工艺。

1.4.3 线性关系考察

精密吸取1.3.1 项下人参皂甙混合对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 和30 μL，注入高效液相色谱仪，按1.3.2 项下色谱条件测定，以进样量为横坐标，人参总皂甙含量为纵坐标，进行线性回归。

1.4.4精密度试验

取1.3.1 项下配制的供试品溶液10 μL，按1.3.2项色谱条件连续进样6 次，分别记录人参皂甙Rg1、Re、Rd 的峰面积，计算人参皂甙总含量。

1.4.5重复性实验

取同产地同一批人参茎叶样品粉末约5 g，按1.3.1 项方法制备6 份供试品溶液，按1.3.2 项色谱条件测定人参总皂甙的含量，记录数据。

1.4.6稳定性实验

精密吸取1.3.1 项配制的人参茎叶样品供试品溶液，按1.3.2 项色谱条件测定人参总皂甙的含量，每间隔2 h 进样一次，每次10 μL，重复6 次，记录12 h 内人参总皂甙的含量。

1.4.7加样回收实验

取9 份已知含量的人参茎叶粉末（批号Y220101）约5.0 g，精密称定后置于圆底烧瓶，分别加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 的对照品溶液，按1.3.1 项制备供试品溶液，再按1.3.2 项色谱条件测定人参总皂甙含量，计算加样回收率。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果

正交实验结果及方差分析见表2、表3。通过分析正交实验结果，得出各因素对人参茎叶总皂甙含量影响的主次顺序为A＞B＞C＞D，即氧化镁的加入量＞原料粉碎粒度＞提取温度＞超声时间，分析K值得出的最佳条件为A2B2C2D2，即氧化镁加入量为0.10 g，原料过40 目筛，提取温度为60 ℃，超声提取时间为1.5 h。

表2 正交实验结果

表3 人参茎叶总皂甙正交实验方差分析

2.2 人参茎叶总皂甙最佳提取工艺验证

为了验证得出的最优组合的可靠性、准确性，同时排除偶然性，本实验按照A2B2C2D2组合，在氧化镁加入量为0.10 g，原料过40 目筛，60 ℃下超声提取1.5 h 的条件下进行验证实验，平行3 次。实验得出，该条件下人参茎叶原料中总皂甙含量平均值为3.93%，优于正交表中第5 组结果。因此确定最佳原料前处理工艺为氧化镁加入量0.10 g，原料过40目筛，温度60 ℃，超声提取时间1.5 h。

2.3 线性关系

以进样量为横坐标，人参总皂甙含量为纵坐标，线性回归方程为Y=1.605 92X+18.629 33，r=0.999 6，表明方法线性关系良好。

2.4 精密度

按1.4.4 项方法得到人参总皂甙的含量分别为3.78%、3.81%、3.85%、3.79%、3.87% 和3.75%，RSD=1.18%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5 重复性

按1.4.5 项方法得到人参茎叶原料中人参总皂甙含量为3.85%、3.76%、3.79%、3.86%、3.81%和3.89%，RSD=1.27%（n=6），表示本方法重复性良好。

2.6 稳定性

按1.4.6 项方法每间隔2 h 进样一次，得到人参茎叶原料中人参总皂甙含量为3.79%、3.85%、3.86%、3.80%、3.87%和3.75%，RSD=1.24%（n=6），实验结果表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收实验结果

人参茎叶中人参总皂甙的加样回收实验结果见表4，人参总皂甙的平均加样回收率为99.4%，RSD值为0.25%（n=9），表明本方法回收率良好。

表4 人参总皂甙回收率实验结果（n=9）

3 讨论与结论

本文以人参茎叶原料中总皂甙含量为考察指标，通过对氧化镁的加入量、粉碎的粒度、提取温度和超声时间进行正交实验，优化人参茎叶原料中总皂甙含量检测的前处理工艺，确定人参茎叶原料的检测方法并进行方法学考察。

人参茎叶原料前处理的最佳工艺为氧化镁加入量0.10 g（即原料重量的2%），原料过40 目筛，提取温度60 ℃，超声提取时间1.5 h。其中氧化镁的添加量对提取结果的影响最大，一方面由于氧化镁可以吸附提取液中的叶绿素等杂质，消除了杂质对有效成分包裹影响含量检测，另一方面氧化镁为碱性，可以改变细胞壁的透过性，使有效成分能更好的溶出，同时也增大了其他杂质的溶出[7]。其次是原料粉碎粒度，当原料的颗粒较大时，相同质量的样品在提取过程中与提取溶剂的接触表面积较小，会使各物质无法被充分提取；当粉碎粒度过小，表面吸附作用加强，有效成分扩散速度受到影响，而且用水提取时黏液质等杂质会由于粉过细而产生胶冻现象，导致大量细胞破裂，溶质间更易形成糊状，不仅影响有效成分的浸出，且不易过滤[8]。提取温度对结果的影响具有双重性，升高温度可以降低液体黏度，减小传递阻力，同时可以促进分子热运动，提高扩散系数，并增加溶质的溶解度，有利于有效成分提取，但温度过高会使物质分解变性，最终导致总皂甙含量降低。为了使有效成分完全传递至提取液中需要一定的时间，达到一定时间后，传递趋于平衡，净传递量不再增加，提取过程中可能会由于分解或其他杂质的溶解使提取率降低，另外提取时间过长会增加操作成本。

本研究中人参茎叶原料提取液不需要通过层析柱纯化，而是优化原料前处理条件，将提取液中的人参皂甙萃取到目标体系，直接进行高效液相色谱检测。通过正交实验确定人参茎叶原料前处理的最佳工艺为氧化镁加入量0.10 g（即原料重量的2%），原料过40目筛，提取温度60 ℃，超声提取时间1.5 h。通过方法学验证，确定人参茎叶原料中人参皂甙含量的检测方法可靠、准确，可为今后人参茎叶原料的检测提供参考。