蒲公英根多糖的提取工艺优化

李霞

（齐鲁医药学院，山东淄博 255300）

蒲公英属菊科，有清热解毒、利尿通淋、健胃消炎和保肝利胆的功效。蒲公英药效成分复杂，主要包括多糖类、黄酮类、甾醇类等。蒲公英中所含的多糖药理作用广泛，可以提高机体免疫力、降低血糖、抑菌、抗癌，也可以通过抗氧化作用起到保护肝脏的效果[1]。

酶提取法可以提高提取率并维持多糖的活性，受到广泛关注。纤维素酶可以水解植物的细胞壁，让提取溶剂快速进入组织细胞中，因而提高了多糖的提取率，缩短了多糖的提取时间；木瓜蛋白酶可以水解糖蛋白和多糖中的游离蛋白，有利于植物多糖的提取。如徐澜等[2]采用木瓜蛋白酶对蒲公英进行酶解，多糖得率为3.11%；WANG 等[3]利用纤维素酶提取蒲公英多糖，多糖得率达到了20.67%。复合酶提取法能够更有效地提高多糖提取率，如刘珊珊等[4]以蒲公英根烘焙粉为样品，探究了单酶和双酶协同条件下多糖得率，结果表明双酶法多糖提取率为32.97%±0.13%，优于单酶法。

目前测定植物多糖常用苯酚-硫酸法，该法方便、灵敏、稳定，适用于单糖、低聚糖和多糖的含量测定[5]。基于此，本文以多糖总提取率为考察指标，通过单因素实验和正交试验设计优选超声辅助复合酶法的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器

UV-2550 分光光度计，日本岛津株式会社；FA2204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；XL-20B 密封型摇摆式粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；KQ-800KDE 高功率数控超声波清洗器、SHBIII 循环水式多用真空泵，上海申生科技有限公司。

1.2 试剂

蒲公英根粉末样品，产自云南，将蒲公英根干燥、去杂、粉碎、过筛后制得。无水葡萄糖标准品，HPLC ≥99%，上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙醇、苯酚，分析纯，莱阳市康德化工有限公司；柠檬酸、磷酸氢二钠，分析纯，天津恒兴化学试剂有限公司；纤维素酶（10 万U/g）、木瓜蛋白酶（10 万U/g），南宁庞博生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精密称取干燥恒重的葡萄糖对照品0.020 1 g，加入蒸馏水定容至10 mL，得到2 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。

吸取2.0 mL 葡萄糖标准溶液于25 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，之后准确吸取1.0 mL 到干燥洁净的具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇晃均匀后迅速滴入浓硫酸5.0 mL，充分混合均匀，冷却到室温后静置30 min，测得最大吸收波长为488 nm。

分别吸取葡萄糖标准溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL 和3.5 mL 于25 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。分别吸取1.0 mL 不同浓度的葡萄糖溶液到具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇晃均匀后迅速滴入浓硫酸5.0 mL，充分混合均匀，冷却到室温后静置30 min；另取1.0 mL 水，用相同方法操作作为空白对照。用紫外可见分光光度计在波长488 nm处测定吸光度，以吸光度对葡萄糖浓度作图，得到标准曲线，如图1 所示。线性回归方程y=1.791 4x+0.063 5，R2=0.999 6。

图1 苯酚-硫酸法测得的葡萄糖标准曲线

1.3.2 供试品的制备

蒲公英根粉末2.0 g 加适量蒸馏水，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节pH 值。超声波处理一段时间后，加入适量纤维素酶悬液和木瓜蛋白酶悬液，酶解适当时间后进行高温灭酶，冷却过滤，收集滤液，减压浓缩，浓缩后的液体加入四倍量的95%乙醇溶液，冷藏静置12 h，抽滤后取固形物，干燥得蒲公英根粗多糖。

1.3.3 供试品溶液吸光度的测定

称取100 mg 粗多糖，加水定容至50 mL 后吸取2.0 mL 样品溶液加水定容至25 mL，得到供试品溶液。吸取1.0 mL 供试品溶液到具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL 摇匀，迅速滴入浓硫酸5.0 mL，充分混匀。冷却至室温，放置30 min，在波长488 nm 处测定吸光度。按照公式（1）计算多糖提取率。

式中，Y为蒲公英根多糖的提取率，%；c为供试品多糖浓度，mg/mL；D为稀释倍数；v为多糖提取液体积，mL；m为蒲公英根样品粉末质量，mg。

1.3.4 单因素实验

（1）最佳超声时间。取蒲公英根粉末2.0 g，料液质量比1 ∶30，pH 为5.0，超声功率300 W，酶各2 mL（均为200 U/mL），酶解时间90 min，温度55 ℃，分别超声20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，计算多糖提取率。

（2）最佳超声功率。取蒲公英根粉末2.0 g，料液质量比1 ∶30，pH 为5.0，超声时间30 min，酶各2 mL，酶解时间90 min，温度55 ℃，超声功率分别设定为200 W、250 W、300 W、350 W、400 W，计算多糖提取率。

（3）最佳酶用量。取蒲公英根粉末2.0 g，料液质量比1 ∶30，pH 为5.0，超声功率350 W，超声时间30 min，酶解时间90 min，温度55 ℃，两种酶各取1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，计算多糖提取率。

（4）最佳pH。取蒲公英根粉末2.0 g，料液质量比1 ∶30，超声功率350 W，超声30 min，酶解时间90 min，温度55 ℃，酶各2 mL，pH分别调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，计算多糖提取率。

（5）复合酶解时间。取蒲公英根粉末2.0 g，料液质量比1 ∶30，pH 为5.0，超声功率350 W，温度55 ℃，超声30 min，酶各2 mL，分别酶解30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，计算多糖提取率。

1.3.6 正交实验

根据单因素实验结果，确定超声功率、超声时间、酶解时间及溶液pH 为影响较大的四个因素，设计L9(34)正交实验优化蒲公英根中多糖的提取工艺，实验参数如表1 所示。

表1 正交实验设计表

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 最佳超声时间

如图2 所示，多糖提取率随超声时间延长呈先升高后降低趋势，40 min 时提取率最高；超声时间过长会破坏局部多糖的结构，使粗多糖提取率下降，因此选择超声时间30 min、40 min、50 min 进行正交实验。

图2 超声时间对多糖提取率的影响

2.1.2 最佳超声功率

如图3 所示，超声功率从200 W 增加到350 W 时，多糖快速溶出，提取率随功率增加逐渐上涨，当功率超过350 W 时，得率骤然降低。因此，选取超声功率为300 W、350 W、400 W 进行正交实验。

图3 超声功率对多糖提取率的影响

2.1.3 最佳酶用量

如图4 所示，复合酶用量从2.0 mL 提高到4.0 mL时，多糖提取率明显升高。继续增加酶用量，提取率基本不变，因此确定复合酶用量为4.0 mL，即纤维素酶、蛋白酶用量各2.0 mL。

图4 复合酶用量对多糖提取率的影响

2.1.4 最佳pH

如图5 所示，pH 为4.5 时粗多糖提取率达到最大值，增大pH，多糖提取率反而下降。因此，选择pH值为4.0、4.5、5.0 进行正交实验。

图5 不同pH 值对多糖提取率的影响

2.1.5 复合酶解时间

如图6 所示，酶解90 min 时多糖提取率最高，酶作用时间过长多糖提取率反而下降，因此复合酶作用最佳时间为90 min，选择酶解时间为60 min、90 min、120 min 进行正交实验。

图6 酶解时间对多糖提取率的影响

2.2 正交实验

如表2 所示，根据K值可得最佳提取工艺组合为A1B1C3D3，即超声波功率300 W，超声时间30 min，复合酶作用时间120 min，溶液pH 5.0。而根据多糖提取率结果，最佳组合为A3B1C3D2，即超声波功率400 W，超声时间30 min，复合酶作用时间120 min，溶液pH 4.5。通过比较极差可得，四个因素对多糖提取率的影响排序为超声功率＞溶液pH ＞超声时间＞酶解时间。

表2 正交实验结果

2.3 验证

为进一步验证最佳工艺条件，在A1B1C3D3的条件下进行3 次重复性验证试验，得到多糖平均提取率为9.068%。另外对编号7 的组合进行3 次重复性实验，得到多糖平均提取率为8.970%。因此，最佳工艺组合确定为A1B1C3D3。

3 结论

基于单因素实验结果，设计L9(34)的正交实验优化蒲公英根多糖提取工艺，结果表明，对提取效果影响最大的是超声功率，其次是溶液pH 及超声时间，而酶解时间的影响较小；超声辅助复合酶提取蒲公英根多糖最佳工艺为A1B1C3D3，即超声作用时间30 min，超声波功率300 W，溶液pH5.0，复合酶作用时间120 min。在最佳条件下，平行试验三次，得到蒲公英根中多糖平均提取率为9.068%。