MyD88 和TRIF 在乳房和乳房外Paget 病皮损组织中的表达

周文文，魏丽萍，王皓敏，王良民，张士发

（1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁沈阳 110016；2.大连医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁沈阳 110016；3.东北国际医院，辽宁沈阳 110623）

Paget 病（Paget's disease，PD）是一种少见的低度恶性的皮肤肿瘤，根据其发病部位分为乳房Paget 病（Mammary Paget's disease，MPD）和乳房外Paget 病（Extramammary Paget's disease，EMPD）。Toll样受体（TLR）属于模式识别受体，TLR 信号转导通路包括髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）和β-干扰素TIR 结构域衔接因子（TIR domain-containing adaptor molecule inducing IFN-β，TRIF）依赖的信号通路。许多研究表明，TLR参与了肿瘤的发生发展。本研究通路观察TLR 中的2 个关键信号通路因子MyD88 和TRIF 在MPD 和EMPD 肿瘤组织中表达水平的变化，探讨其在MPD和EMPD 发生发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源 采集20 例MPD 和20 例EMPD 患者皮损组织石蜡标本并经临床及组织病理学确诊。MPD 皮损组织均为女性，年龄31～72 岁，平均（54.30±12.06）岁；EMPD 皮损组织男性17 例，女性3 例；年龄52～84 岁，平均（71.15±9.72）岁。所有纳入标本的患者术前均未进行放疗和化疗，无特殊既往史及过敏史。以10 例手术患者切除的良性组织病灶外2 cm 并经病理学确认为正常皮肤组织作对照，其中男性6 例，女性4 例；年龄20～68 岁，平均（44.60±16.00）岁。

1.2 主要试剂 兔抗人MyD88 单抗、兔抗人TRIF单抗和免疫组化染色试剂盒均来自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验方法 采用免疫组化染色法，按免疫组化二步法说明书进行操作。石蜡切片常规脱蜡水化，高压锅修复抗原，分别滴加MyD88、TRIF 稀释一抗工作液，工作浓度为1∶500，4 ℃冰箱过夜（时间≥12 h），加二抗工作液37 ℃孵育20 min，3，3-二氨基联本胺（DAB）染色液显色，苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断 由2 位高年资皮肤病理科医生独立对免疫组化结果进行评估，在显微镜下随机选取5 个独立高倍视野（×400），结合染色强度和阳性细胞百分比进行结果判断。染色强度评分标准为：0 分（无染色或细胞染色与背景无异）、1 分（淡黄色-弱染色）、2 分（棕黄色-中度染色）、3 分（棕褐色-强染色）；阳性细胞百分比：0 分（无）、1 分（1%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%），以染色强度和阳性细胞百分比的乘积进行结果判定：0 分为阴性（-），1～3 分为弱阳性（+），4～6 分为阳性（++），≥7 分为强阳性（+++）。其中，将强阳性及阳性定义为高表达，弱阳性定义为低表达[1]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，Pearson 相关性分析法分析MyD88 与TRIF 的相关性。以α=0.05 为检验水准，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MyD88 的表达 在MPD 皮损组织中MyD88的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在EMPD 皮损组织中MyD88 的阳性表达主要位于细胞质和细胞核上，亦呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在正常组织中MyD88 呈弱阳性表达，主要见于角质形成细胞的细胞质上，呈淡黄色颗粒状分布，如图1。MyD88 在MPD 和EMPD 的表达均显著高于正常组织（均P<0.05），但在MPD 与EMPD 间的表达差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 MyD88 及TRIF 在MPD、EMPD 和正常组织中的表达水平比较（±s）

表1 MyD88 及TRIF 在MPD、EMPD 和正常组织中的表达水平比较（±s）

注：与MPD 比较，aP<0.05；与EMPD 比较，bP<0.05。

样本位置n MPD20 EMPD20正常组织10 TRIF 表达强度4.50±2.33 4.60±2.56a 1.67±2.17ab MyD88 表达强度5.32±3.25 4.96±3.21a 2.40±2.07ab

图1 MyD88 在MPD、EMPD 和正常组织中的表达

2.2 TRIF 的表达 在MPD 皮损组织中TRIF 的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在EMPD 皮损组织中TRIF 的阳性表达主要位于细胞质和细胞核上，也呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在正常组织中TRIF 呈弱阳性表达，主要位于角质形成细胞的细胞质上，呈淡黄色颗粒状，见图2。TRIF 在MPD 和EMPD 的表达均显著高于正常组织（均P<0.05），但在MPD 与EMPD 间的表达差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

图2 TRIF 在MPD、EMPD 和正常组织中的表达

2.3 MyD88 与TRIF 的相关性分析 通过Pearson相关性分析二者的相关性，发现在MPD 和EMPD 皮损组织中，MyD88 和TRIF 的表达均无线性相关性（r 分别为-0.114 和0.185，P 分别为0.632 和0.436）。

3 讨论

MPD 绝大多数累及女性，好发于单侧乳房、乳晕及其周围，平均发病年龄55 岁，男性罕见；EMPD大多好发于男性，皮损好发于顶泌汗腺分布部位，如阴囊、会阴、肛周和腋窝等，平均发病年龄大于MPD。有关PD 的病因和发病机制较多，但目前尚不完全明确。

MyD88 是一种衔接蛋白，属于Toll/白细胞介素-1受体（IL-1R）家族和死亡结构域家族成员，在多种肿瘤组织中高表达，但未见其与MPD 和EMPD 的相关研究。有研究表明，在乳腺癌中TLR4 和MyD88的基因和蛋白均高表达，且表达强度与肿瘤大小、分期、淋巴结转移和远处转移显著相关性，在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要的促进作用[2]。也有研究表明，通过沉默人结肠癌细胞株SW480 和HCT116 细胞中的MyD88，可以抑制脂多糖（LPS）诱导的结直肠癌迁移、侵袭和增殖，恢复MyD88 后，LPS 可通过核转录因子κB（NF-κB）/丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促进肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖活力[3]。MyD88 在卵巢癌组织中表达也明显升高，且与患者的临床分期及淋巴结转移有关[4]。本研究表明，MyD88 在MPD 和EMPD 皮损组织中的表达均显著升高，提示MyD88 可能通过与乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌类似的机制参与了MPD 和EMPD疾病进展过程，因为TLR/MyD88 信号通路异常激活会产生一系列炎性因子和细胞因子（包括免疫抑制性细胞因子），会引起免疫抑制和免疫逃逸，最终导致肿瘤的生长、侵袭和转移[5]。

由TRIF 介导的信号通路被称为MyD88 非依赖信号通路，TRIF 只能通过TLR3 和TLR4 通路发挥作用。其中TLR3 可以直接绑定TRIF，从而激活下游信号通路。TLR3 可以促进头颈部肿瘤的发展，并且可以被顺铂激活，保护顺铂诱导的肿瘤细胞脱氧核糖核酸（DNA）损伤反应，从而导致癌细胞对顺铂产生耐药，进一步证实了TLR3 在头颈部肿瘤的发生发展及药物治疗中的作用[6]。而TLR4 需要间接通过TRIF 相关的接头分子（TRAM）与TRIF 绑定，才能激活下游一系列级联反应。TLR4 在乳腺癌中显著上调与晚期肺癌淋巴结转移（TNM）分期相关，其可以通过上调NF-κB 调节因子的表达，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制乳腺癌细胞的凋亡[7]。目前国内外关于TRIF 与肿瘤之间关系研究较少。有研究显示，乳腺癌组织中TRIF 基因和蛋白表达水平均显著升高，而且在乳腺癌不同阶段的表达出现差异化，认为TRIF 的表达与乳腺肿瘤的增殖和分化密切相关[8]，其作用机制也应该是通过TLR3 和TLR4 介导而实现[6-7]。本研究表明，TRIF 在MPD 和EMPD 肿瘤组织中的表达均显著升高，提示TRIF 的异常激活可能通过TLR3 和TLR4 通路造成了Ⅰ型干扰素的过多表达和NF-κB 的过度活化，传递出肿瘤生长信号，引起了肿瘤细胞的生长和抗凋亡蛋白的表达，从而促进了肿瘤的发展进程[9]。

本研究表明，在MPD 皮损组织中MyD88 和TRIF 阳性表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜上，说明二者能在MPD 细胞的胞质和胞膜上与不同的TLR（包括内涵体内和细胞膜上）结合，激活下游通路，促进肿瘤的进展；在EMPD 皮损组织中MyD88和TRIF 阳性表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞核上，说明二者可分布于EMPD 细胞的细胞质和细胞核上，活化相关因子，从而发挥相应的促癌作用。MyD88 在MPD 和EMPD 细胞中阳性表达的部位的研究，国内外尚未见报告，TRIF 也是如此，因此关于二者在Paget 细胞中的表达部位情况还有待进一步研究和探索。

本研究还表明，MyD88 在MPD 与EMPD 皮损组织中的表达强度差异无统计学意义，提示MyD88在MPD 和EMPD 的病理过程中可能通过相同的信号通路发挥促癌作用。TRIF 与MyD88 类似，在MPD 和EMPD 皮损组织中的表达强度差异也无统计学意义，提示TRIF 在MPD 和EMPD 中皮损组织也均发挥促癌作用，而与PD 的发病部位无关。关于MyD88 与TRIF 在MPD 和EMPD 发生发展中的详细作用机制，还有待进一步探讨。

有关MyD88 和TRIF 在恶性肿瘤中表达相关性的研究，国内外鲜有报告。本研究表明，在MPD和EMPD 皮损组织中，MyD88 和TRIF 的表达均无相关性。在TLR 信号转导通路中，MyD88 可以被除TLR3 以外所有的TLR 所介导（包括TLR4），而TRIF 只能被TLR3 和TLR4 所介导，TLR4 是唯一可以同时激活MyD88 和TRIF 2 条信号转导通路的TLR，2 条信号通路可共同激活下游肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）分子，引起NF-κB 的活化和释放，导致大量炎性因子和细胞因子的表达，进而促进肿瘤的进程[5]，表明MyD88 和TRIF 可以通过TLR4 信号通路相互联系，由此推测二者可能有一定的相关性。但是MyD88 还可以由其他TLR（除TLR3 和TLR4）介导而激活下游通路发挥作用，而TRIF 可以由TLR3 介导而激活下游通路发挥作用，此时MyD88 和TRIF 可以没有相关性。因此MyD88和TRIF 的表达强度可以不呈线性相关关系，其详细作用机制仍有待进一步探讨。