荧光PCR 技术在麝香壮骨膏控制菌检查中的应用

李宏铎，李亚楠，沙 淼，夏 天，崔 迎，杨晓莉

（1.西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054；2.国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065；3.陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065）

2020 年版《中国药典》 四部0122 贴膏剂规定贴膏剂包括凝胶贴膏（原巴布膏剂或凝胶膏剂） 和橡胶贴膏（原橡胶膏剂）［1］。2005 年版《中国药典》 二部微生物限度检查法引入验证理念，使得检测结果更科学准确［2］。在微生物限度检查项下规定，凝胶贴膏和橡胶贴膏的控制菌为每10 cm2不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 在自然界中广泛存在，30%～80% 的人为该病原菌的携带者［3］，约32%的食品中含有该菌［4］，金黄色葡萄球菌也是最常见的化脓性感染致病菌［5］。而铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 为条件致病菌，可引起伤口、呼吸道、泌尿道的感染［6-7］。目前药品微生物检查的生化方法，操作繁琐，时间长［8］，需要建立更加准确、快速的检测方法。

药品控制菌检验的技术有实时荧光PCR 技术、变性梯度凝胶电泳、随机引物扩增多态性技术、基因芯片技术、核酸分子杂交技术等［9-10］。实时荧光PCR 灵敏度高，特异性好，是目前微生物检验重要手段［11］。多重荧光PCR 通过使用多对引物、探针，能同时对多个目标序列检测，结果更快速、准确［12］。刘婷婷等［13］建立了实时荧光PCR 技术检验金黄色葡萄球菌。申应德等［14］建立了药品中沙门菌荧光PCR 方法。柯振华等［15］建立了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌的多重PCR 方法。张静等［16］提出了食源有害微生物DNA 快速提取与多重PCR 检测初探。胡兴娟等［17］进行了四重荧光定量PCR 法对肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌的鉴定。

1 材料

1.1 仪器与试剂 LC480 荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）；5430R 高速冷冻离心机、Biospectrometer 紫外／可见光／荧光分光光度计（德国艾本德公司）。细菌基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京） 有限公司］；荧光定量PCR 反应试剂盒（日本TaKaRa 公司）；胰酪大豆胨琼脂培养基（北京三药科技开发公司）。水为超纯水。

1.2 菌株 见表1。

表1 菌株样品信息

1.3 引物及探针 参考文献［18］ 报道，金黄色葡萄球菌根据femB基因序列，铜绿假单胞菌根据ETA基因序列设计引物及探针，见表2。

表2 引物与TaqMan 探针

1.4 药物 本实验样品为2021 年国家药品评价性抽验品种麝香壮骨膏，共计全国40 个生产厂家，260 批。按照2020 年版《中国药典》 四部检查控制菌后，均为未检出，作为阴性样品。

2 方法

2.1 细菌培养及模板DNA 的提取 分别吸取1 mL 菌株的纯培养液，细菌基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，Biospectrometer 紫外／可见光／荧光分光光度计测定核酸浓度。建立DNA 模板库，保存于-20 ℃备用。

2.2 荧光定量PCR 检测方法 双重荧光定量PCR 反应体系为25 μL，体系组成为10×Probe qPCR mix 12.5 μL，正向、反向引物（10 mol／L） 各1 μL，探针0.5 μL，模板DNA 2 μL，加水至25 μL。实时荧光定量PCR 仪反应参数为95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火并延伸45 s，共40 个循环，在每个循环的60 ℃退火并在延伸阶段收集荧光信号。设立培养基提取阴性对照，无菌水为空白对照。

2.3 灵敏度 按“2.2” 项下反应体系对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行双重荧光PCR 反应，将DNA 模板10倍系列稀释，同时用胰酪大豆胨琼脂培养基对其进行菌落计数。选取10-1～10-6DNA 浓度，其对应的初始菌浓度对数值与Ct 值作标准曲线。

2.4 特异性 按“2.2” 项下反应体系将24 株菌的DNA同时添加为模板，进行双重荧光定量PCR 反应。此24 种菌为日常药品检测中常见菌种、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、球菌、杆菌的典型代表，同时加入模板可以范围更广的证明所用引物特异性的优劣。

2.5 重复性 选取不同浓度金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌DNA 模板混合后，进行3 次PCR 分析，比较重复性。

2.6 控制菌检查方法 取供试品100 cm2，加5 mL 聚山梨酯80，再加pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，静置，取水相为1 ∶10 的供试液，分别取10 mL 供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基中混匀，一份按照《中国药典》 规定方法进行检验，另一份将菌液浓度为10 cfu／mL 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌加入到培养基中，35 ℃培养24 h，取增菌液1 mL，按细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA 作模板，进行荧光定量PCR 检测。

3 结果

3.1 灵敏度试验结果 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌基因组DNA 梯度稀释至10-6。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌最低检测限分别为20、10 cfu／mL，结果见图1～2。以DNA 稀释倍数为横坐标（X），Ct 值为纵坐标（Y） 进行回归，得到金黄色葡萄球菌方程为Y＝3.536X+13.77 （R2＝0.998 7），铜绿假单胞菌方程为Y＝3.325X+15.68 （R2＝0.997 2）。表明Ct 值与DNA 浓度的对数值的线性关系良好，检测体系准确可靠。

图1 金黄色葡萄球菌灵敏度试验结果

图2 铜绿假单胞菌灵敏度试验结果

3.2 特异性试验结果 双重荧光定量PCR 反应对24 株菌株的结果见图3～4。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌Ct 值分别为16、17，其他菌株均为阴性反应。表明对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的双重荧光PCR 反应特应性好，能够同时用来检测贴膏剂中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌这2 种控制菌。

图3 金黄色葡萄球菌特异性试验结果

图4 铜绿假单胞菌特异性试验结果

3.3 重复性试验结果 相同浓度每次扩增曲线基本吻合。金黄色葡萄球菌的Ct 值分别为15.43、15.36、15.39，变异系数为0.19%，铜绿假单胞菌的Ct 值分别为18.22、18.31、18.27，变异系数为0.20%，均小于2%，表明该方法重复性良好。结果见图5～6。

图5 金黄色葡萄球菌重复性试验结果

图6 铜绿假单胞菌重复性试验结果

3.4 控制菌检查方法结果 采用建立的双重荧光PCR 方法和药典规定的控制菌检验方法，对来自40 个药厂的271份国家药品评价性抽验麝香壮骨膏同时进行检验，2 种方法均未检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，结果一致。

4 讨论

药品中污染微生物是评价药品质量和安全性的重要指标，药品控制菌检查是对微生物污染进行定性检测［19］，随着GMP、《中国药典》 和相关技术指南的不断提高，对于药品及其生产过程中微生物的检测、鉴定和溯源的要求，分子生物学方法开始应用于药品微生物检验中来。

本研究建立的双重实时荧光PCR 方法，确定了反应体系和反应参数，通过对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与样品和环境中污染概率较大，一些生化反应相同的干扰菌株同时进行检验，表明该方法特异性高，满足日常检验需求。实时荧光PCR 检测下限为10～100 cfu［20］。本研究建立的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检测限分别可达到20、10 cfu／mL，具有良好的灵敏度。但荧光PCR 法也存在不足，传统的生化检验方法，活菌能够被培养，进而被分离鉴别，而死菌不能够被培养，也就无法被检测到。由于灭菌工艺的不同，死菌可能残留在样品中，通过荧光PCR 方法死菌也会被检测到而判定为阳性。这也可能是荧光PCR方法没有被广泛应用于的药品控制菌检验中的原因之一。

麝香壮骨膏工艺中虽无灭菌工艺，但由于制法中药品原料都经过熬制微生物污染可能小，辅料与包装过程可能存在污染。虽然没有阳性结果数据，通过阴性结果数据表明荧光PCR 方法具有灵敏、快速特点，提高了药品日常检验工作的效率，对日常的药品微生物检验工作中，大批量相同样品的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的污染的初筛，双重荧光PCR 法能够提供有效的帮助，也为今后建立不同组合和更多控制菌的同步检测打下了良好基础。