猪粪堆肥复合菌剂培养条件优化及其对好氧堆肥的影响

王 聪,冀红柳,尹 苗,易浩楠,张莉萍,邓永涛,陈希文*

(1.绵阳师范学院动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心,四川绵阳 621000;2.四川生猪重大疫病监测与防控工程研究中心,四川绵阳 621000)

随着生活质量的提高,畜禽养殖业在我国得到了快速发展,畜牧经济增长迅速[1]。然而,随着畜禽养殖规模化程度的不断提高,畜禽粪尿排泄物集中产生、乱堆乱放,使得畜禽养殖带来的环境污染问题日益严重[2-3]。据统计,我国每年畜禽粪污产生量高达38亿t,但综合利用率却不足60%[4]。然而,畜禽中含有丰富的有机质和营养元素,可以进行堆肥处理,使其成为可用资源[5]。随着现代生物技术的快速发展及高效化应用,添加微生物菌剂已成为堆肥发酵中的常用手段[6]。添加微生物菌剂可调节堆体微生物群落结构,缩短发酵时间[7],迅速有效分解纤维素等有机物质[8],提高堆肥产品的肥效[9-11],减少恶臭气体的排放[12],对改善生态环境、实现资源循环利用具有重要意义[13]。响应面优化分析法作为一种试验次数少、周期短,求得的回归方程精度高,能研究几种因素间交互作用的回归分析,则常用于菌剂的条件优化[14],进而使复合菌剂的活菌数达到最优,为复合菌剂的扩大培养和开发提供技术支持。笔者将复合菌剂应用于实际猪粪好氧堆肥过程,探究自制复合菌剂的可行性,以期为生物发酵堆肥应用研究提供理论基础与参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料新鲜猪粪收集于四川铁骑力士养殖场;玉米芯由绵阳师范学院人工气候室提供;堆肥样品来自四川铁骑力士公司;凋落物来自学校凋落物、野外凋落物;厨余垃圾周围土壤取自学校食堂垃圾堆周边。堆肥原料基本信息见表1。

表1 堆肥原料基本信息

纤维素降解菌筛选培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.00 g,NaCl 5.00 g,K2HPO41.00 g, MgSO4·3H2O 0.50 g,NaNO33.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂20.00 g,去离子水1 000 mL。淀粉降解菌筛选培养基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、琼脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌筛选培养基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,罗丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,琼脂粉15.00 g,菜籽油12.00 mL,去离子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。纤维素降解菌产酶培养基:CMC-Na 10.00 g,蛋白胨2.00 g,酵母提取物2.00 g,蒸馏水1 000 mL,自然pH。淀粉降解菌产酶培养基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、琼脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌产酶培养基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,罗丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,菜籽油12 mL,去离子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。种子培养基:葡萄糖5.00 g,酵母粉5.00 g,K2HPO41.00 g,NaCl 5.00 g,蒸馏水1 000 mL,pH自然。

1.2 方法

1.2.1菌种的筛选。从新鲜猪粪、堆肥样品、凋落物、厨余垃圾周围土壤中筛选菌种,接种于纤维素、淀粉、油脂培养基上,分别选出对纤维素、淀粉、油脂降解率高的菌种,将其分别命名为XWS、DF、YZ。对各菌株进行拮抗试验,选择相互无拮抗作用的菌株用于堆肥复合菌剂的制备。

1.2.2复合菌剂单因素条件优化。进行单因素试验[15]前,为了确保试验的准确性,对初始菌液浓度进行统一。在灭菌后的LB培养液中接入由1∶1∶1复合而成的微生物菌液,在37 ℃ 180 r/min条件下培养18 h。在OD600调零的分光光度计下,以未接种菌液的LB培养液作为对照,在空比色皿中加入不同体积的混合菌液和LB培养液,直至OD值为1.0后依据这个比值,在新的已灭菌的锥形瓶中进行混合,并重新测定锥形瓶中混合液的OD600,再次根据重新测定的OD600微调至OD值为1.0为止。之后每次相关试验所需初始菌液浓度均为以上测得数值。然后考虑不同碳源、氮源组合及其添加量,改变不同初始pH、温度、菌液添加量、不同转速,探究每个因素的最优条件,以培养出最优菌剂。

1.2.3复合菌剂Plackett-Burman试验设计。根据单因素试验得出每个因素的最适范围,将每个因素的高低2水平输入Plackett-Burman试验设计[16],对试验的高低水平进行编码,然后生成相应的试验设计表格,将试验数据再次填入试验设计表格进行分析,从而得到对试验影响显著的因素。

1.2.4复合菌剂Box-Behnken试验设计。根据Plackett-Burman试验设计结果对复合菌剂进行Box-Behnken试验设计[17],然后通过生成的试验表格进行试验,进而对试验结果进行数据分析,随后获得相应的回归方程,最后通过该方程得到最佳的活菌数生长条件。

1.2.5堆肥体系构建与取样、指标测定。将玉米芯与猪粪充分混合,置于泡沫箱中。对照空白组:猪粪+玉米芯,不添加任何外源菌剂;处理组:猪粪+玉米芯,添加自制外源菌剂。

为确保堆肥的成功率,以温度变化为依据进行适当的翻堆处理。温度每天记录,每进入一个堆肥阶段进行一次样品采集,每次采样取上、下、左、右、中5个方位,及对应位置的上、中、下3层进行采样,采样四分法分取样品,共采集300 g左右即可。将采集的样品分成2部分,一部分经研磨后过100目尼龙筛,用于后续各项指标的检测试验,另一部分保存。

堆体的总碳、总氮及pH根据《肥料合理使用准则有机肥料》进行测定;含水率以及蚊、蝇密度气味等感官评价参考GB 7959—2012标准测定;种子发芽率计算按NY/T 3442—2019的规定执行;采用失重法测定纤维素降解率,采用分光光度法测定淀粉降解率,采用分光光度法测定油脂降解率[18]。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

2.1.1初筛。从新鲜猪粪等材料中筛得纤维素降解菌22株,淀粉降解菌18株,油脂降解菌23株,共63株。

2.1.2复筛。由于堆肥过程中升温,对菌株的筛选需考虑升温后的酶活性、降解性能。对比37 ℃与55 ℃下各种菌的性能,22株纤维素降解菌在37 ℃均有降解效果,但温度升到55 ℃后仅有如图1a所示的6株,XWS-3、XWS-8、XWS-9、XWS-12、XWS-19酶活大大降低,波动幅度过大,产酶性状不稳定。菌株XWS-22产酶性能较37 ℃时稍下降,其波动在可接受范围内,因此,选择菌株XWS-22作为复合菌剂的目标菌株。

注:a.纤维素降解菌酶活;b.淀粉降解菌酶活;c.油脂降解菌酶活。

在37 ℃培养条件下,18株淀粉降解菌均能产生水解透明圈。温度升至55 ℃时,仅有DF-6、DF-9、DF-11产生水解透明圈,菌株DF-11在2种温度下酶活差异较小,且较为稳定,因此选择DF-11作为制备复合菌剂的目标菌株。

在37 ℃培养条件下,23株油脂降解菌均可产生水解圈。当55 ℃时,仅剩YZ-5、YZ-12、YZ-14、YZ-17、YZ-19、YZ-22、YZ-23这7株菌可以产生透明圈,在37、55 ℃条件下,YZ-23菌株酶活差异小,且效果比较好,因此选择该菌作为复合菌剂的目标菌株。

经鉴定菌株XWS-22为海洋芽孢杆菌,菌株DF-11为巨大芽孢杆菌,菌株YZ-23为枯草芽孢杆菌。

2.1.3拮抗试验。将所得3株菌进行拮抗试验观察,经试验确定3株菌之间无明显拮抗作用(图2),菌株间不会相互抑制生长,可用于复合菌剂制备。

图2 3株菌拮抗试验

2.2 单因素试验结果

2.2.1碳源、氮源。不同碳源、氮源组合下的有效活菌数见表2、3,淀粉+葡萄糖碳源组合、酵母粉+尿素氮源组合培养的有效活菌数最多,分别为3.9×109、2.4×109CFU/g。由图3可知,碳、氮源添加量分别在7和9 g/L时,有效活菌数最高,选择7～9 g/L的碳、氮源添加。但考虑到葡萄糖的影响,对淀粉和葡萄糖分别进行考虑,考虑范围为3.5～4.5 g/L。

图3 不同碳源和氮源添加量下有效活菌数

表2 不同碳源有效活菌数

表3 不同氮源有效活菌数

2.2.2初始pH。不同pH下的有效活菌数如图4所示,pH在7.0～8.0有效活菌数不断增加,达到8.0后,有效活菌数开始下降。

图4 不同初始pH下有效活菌数

2.2.3不同温度、接种量、转速下的有效活菌数。由图5～7可知,随着温度的不断升高,有效活菌数也随之升高,在37 ℃时,有效活菌数开始降低,最适温度为30～37 ℃。随着接种量的不断增加,在接种到7%时,有效活菌数达到最大值,因此选择7%～8%作为下一步试验基础。转速在180 r/min的条件下,有效活菌数最高,因此选择170～190 r/min。

图5 不同温度下有效活菌数

图6 不同接种量下有效活菌数

图7 不同转速下有效活菌数

2.3 Plackett-Burman试验微生物生长发酵所需培养基的成分优化及工艺参数涉及的范围广泛,传统的试验设计效率相对较低,根据单因素试验结果,以表4的7个因素为影响因素,利用Plackett-Burman试验设计,选出有显著影响的因素,并进行线性回归分析,回归方程结果分析见表5。

表4 复合菌剂Plackett-Burman试验设计

表5 Plackett-Burman 试验回归分析

根据Plackett-Burman试验设计得到回归方程为:

有效活菌数=5.130+0.035A+0.167B+0.237C-0.400D-0.075E+0.003E+0.003F+0.143G

模型的F值为18.963,P<0.05说明根据试验设计获得的回归方程模型有意义且较为显著。PredictedR2为0.737,AdjustedR2为0.920,两者之差小于0.2,也证明该模型有意义且相关性好。AdjustedR2为0.920,表明有92%的预测试验结果的变异性,可以使用该模型进行解释。根据P<0.05时,试验因素对试验结果有显著影响为依据可判定出葡萄糖、氮源添加量、pH和接种量对试验有显著影响。

2.4 Box-Behnken试验Box-Behnken试验分析所得回归方程为:

有效活菌数=5.494+0.116A-0.045B+0.238C+0.185D+0.038AB+0.088AC+0.038AD-0.060BC+0.018BD+0.050CD-0.427A2-0.184B2+0.255C2-0.009D2

由表6中试验分析结果可得模型的P<0.05,失拟项的P>0.05,表明该试验模型所得到的回归方程是显著的,具有较为良好的拟合性;R2为0.945,证明该模型可以解释超过94%的试验结果,具有良好的相关性;AdjustedR2为0.889,PredictedR2为0.704,两者相差<0.200,证明该试验具有较为良好的相关性;通过这些试验系数的分析,综合可以得出该试验的结果与软件得出的模型具有较为合适的匹配度,各因素之间相互影响效果如图8所示。

注:a.pH与氮源添加量交互作用的等高线、响应面;b.pH与接种量交互作用的等高线、响应面;c.pH与葡萄糖添加量交互作用的等高线、响应面;d.氮源添加量与接种量交互作用的等高线、响应面;e.氮源添加量与葡萄糖添加量交互作用的等高线、响应面;f.接种量与葡萄糖添加量交互作用的等高线、响应面。

表6 Box-Behnken试验回归分析

据以上试验所得到的回归方程,以有效活菌数为响应值,当需要得到最大值时,最佳试验条件为pH为7.44,氮源添加量为7.825 g/L,接种量为7.999%,葡萄糖添加量为4.499 g/L,有效活菌数达到6.186×109CFU/g。根据实际情况,pH为7.4,氮源添加量为7.8 g/L,接种量为8%,葡萄糖为4.5 g/L,经试验验证得到平均有效活菌数为6.090×109CFU/g,验证试验拟合性良好。

2.5 堆肥指标测定

2.5.1温度。猪粪好氧堆肥堆制过程中温度变化如图9所示,堆体均不同程度经历升温期、高温期及降温期3个阶段的变化。高温期自制菌剂达到的最高温度61.5 ℃,高于空白对照组(55.5 ℃),且高温期延长了2 d。堆肥完成的判定标准为堆体温度与室温持平,自制菌剂组共堆制了20 d,空白对照组堆制了29 d。

图9 好氧堆肥堆制过程中温度的变化

2.5.2C/N。2组堆肥在整个堆制腐熟过程中C/N均呈现下降状态,如图10所示,自制菌剂及空白组的堆肥终产物的C/N分别为9.93、21.37,添加自制菌剂的组对碳氮的利用率更高。

图10 好氧堆肥堆制过程中C/N的变化

2.5.3含水率。如图11所示,2组试验含水率的降低主要发生在高温期阶段,该阶段微生物的代谢作用旺盛,水分蒸腾强烈,含水率降低明显。整个过程中自制菌剂组的含水率均低于空白对照,堆肥最终产品含水率分别为35.69%、22.25%。

图11 好氧堆肥堆制过程中含水率的变化

2.5.4pH。从图12可见,2组堆体pH的变化均呈现先升高后降低最后趋于稳定的趋势,且变化幅度都不大,堆体基本都维持在偏碱性的状态,终产物pH稍微上升。

图12 好氧堆肥堆制过程中pH的变化

2.5.5种子发芽率。自制菌剂、空白对照组的种子发芽率分别为91%和86%,自制菌剂组的种子发芽率高于空白对照组。2组的发芽情况见图13。

图13 各组堆肥产物种子发芽情况

2.5.6感官评价。发酵升温期,堆体均吸引蚊蝇,表面和较深层有虫卵,气味刺鼻,异味扩散范围大;进入高温期后,蚊蝇量和虫卵均减少,随着温度升高,异味逐渐减少,异味范围缩小;腐熟期,蚊和虫卵基本消失,气味消失;堆肥结束后,无蚊蝇和虫卵,气味变为腐殖质的清香。加入自制菌剂的堆体,蚊蝇及虫卵消失的时间比空白对照快。

2.5.7纤维素、淀粉及油脂降解率。空白对照的纤维素、淀粉、油脂的降解率在堆肥过程中均为最低,堆肥产品分别有47.85%的纤维素降解率,48.12%的淀粉降解率,44.01%的油脂降解率。自制菌剂的堆肥产品纤维素降解率可达到64.79%,淀粉降解率高达73.89%,油脂降解率为56.42%(图14)。

3 讨论

3.1 菌种的筛选该研究试验针对性地从不同的环境中采集样品,从中分离初筛得到63株菌,由于堆肥过程中温度会随着微生物的生长繁殖不断升高,进而考虑到温度作用,经过高温条件下的复筛及常温和高温2个阶段的酶活比较,最终筛选到XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分别为纤维素降解菌、淀粉降解菌和油脂降解菌。XWS-22酶活在37 ℃和55 ℃条件下分别为(48.32±1.22)、(32.78±0.23) U/mL;DF-11的酶活在37 ℃为(31.56±0.67) U/mL,55 ℃条件下为(30.41±1.07) U/mL,XWS-22和DF-11的酶活在高温下比常温下均不同程度的下降,XWS-22的酶活下降较多,而DF-11酶活对温度敏感程度不高;YZ-23的酶活在37 ℃条件下为(30.36±1.23) U/mL,55 ℃为(31.28±1.03) U/mL,YZ-23在高温情况下酶活更高一些,该菌株对温度敏感程度不高,甚至可能更适合高温环境。堆肥过程中有明显的温度变化,微生物产酶活性的高低对于有关物质的分解有显著影响,敖静等[19]在鸡粪堆肥中发现纤维素酶与总菌数呈现正相关,而细菌总数又受到温度的影响。因此,筛选对于温度变化影响酶活较为稳定的菌株对复合菌剂的配制是有必要的,并且总菌数对于整体酶活也有一定程度的影响,该试验在下一步配制复合菌剂应以有效菌活数作为评价指标。

经鉴定,菌株XWS-22、DF-11、YZ-23分别为海洋芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌,这3株菌均无致病性与毒性,一定程度上还能抑制土壤中其他生物毒素的产生,促进植株生长[20-21];经拮抗试验验证XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌无明显拮抗作用,可用于复合菌剂的制备。

3.2 复合菌剂的培养条件优化按照1∶1∶1混合后的菌剂在发酵中会受培养液中不同因素的影响,碳源、氮源的种类及添加量、发酵温度、初始的pH、转速等多种因素都会对菌种的生长繁殖产生影响。单因素优化试验可初步确定复合菌剂的较适范围,王渝昆等[22]通过对产甲烷复合菌剂进行单因素优化试验,确定了最适pH和添加量,为下一步试验提供了理论支撑。张晨敏[23]在秸秆还田的复合菌剂研制中,采用单因素试验确定大致范围,为正交试验提供了数据基础。该试验选取对菌种发酵影响较大的因素,并通过单因素试验确定这些影响因素相对较适的添加组合和范围。其中,较为关注碳源的选择,该试验中3株菌所针对的降解物质不同,因此对碳源的需求也不尽相同。根据试验发现在整个过程中,复合菌剂对葡萄糖作为碳源更为敏感,生长更好,而淀粉+葡萄糖的组合会比单一葡萄糖的效果更好,可能是该株淀粉降解菌对淀粉的利用级高于对葡萄糖的利用级,也可能是3株菌对淀粉均有降解效果。

通过单因素优化试验得到影响因素的较优选择范围,在该基础上进行Plackett-Burman试验设计,以期选择这些影响因素中对复合菌剂菌种培养更为显著的影响因子,为条件的进一步优化提供试验基础。结合单因素试验的分析结果,淀粉对复合菌剂的发酵影响程度不大,分析可能是由于随着葡萄糖的降解,淀粉在生长后期会作为更优质的碳源;温度选择在30～37 ℃,对有效活菌数的增加意义不大,分析可能由于芽孢杆菌自身抗逆性的特点,以及在前期进行筛选时已筛选剔除掉对温度变化敏感的菌株,因此在这个范围内的波动对于这3株芽孢杆菌来说基本无影响;转速在菌种培养中的影响与氧气有关,转速高可带来较高的含氧量,该试验随着转速达到170～190 r/min,在其他因素的共同作用下,转速的P值远大于0.05,说明对菌种有效活菌数的增加影响不显著。

在根据PB试验得到影响最为显著的4个因素的基础上进行 Box-Behnken试验设计,得到最优培养条件,然后进行了4因素3水平响应面优化试验。通过响应面优化得到最适培养条件是可靠的,为不同菌株组成的复合菌剂优化活菌数提供了理论基础,也为工业化提供了技术支持。

3.3 复合菌剂对堆肥的影响将优化后的复合菌剂进行实际猪粪堆肥应用,验证其堆肥效果,其中测定了堆肥温度、C/N、含水率、pH、种子发芽率等,以验证堆肥的腐熟程度以及对纤维素、淀粉和油脂的降解率,从而评定菌剂对各项指标的降解率。

将前期筛选得到的3株菌经发酵优化后应用于实际堆肥试验中,通过设置自制菌剂组和空白对照组进行对照试验,验证自制菌剂的应用与实际堆肥试验的可行性。通过试验可知,添加自制菌剂比空白对照组快50%,同时对堆体利用率也更好。这有力地验证了添加外源菌剂的优势性。张丹等[24]利用微生物资源库构建的CM菌剂,堆肥的最高温度可以达到63.5 ℃,高温期可以达到12 d,提高对垃圾降解率的同时延长了高温期,有助于病原微生物及虫卵等的杀灭。2组堆肥在整个堆制腐熟过程中C/N均呈下降状态,自制菌剂以及空白组的堆肥终产物的C/N分别为9.93、21.37,明显看出加入菌剂组对碳氮的利用率更高,表明外源菌剂的添加有利于堆肥过程中的物质转化,在加快对总体有机碳利用的同时相对有机氮损失少,这与王芳等[25]研究一致。堆肥pH均在7.3～8.4,满足堆肥微生物的pH环境要求,整个过程pH先升高后降低,后期一定程度升高,终产物均呈弱碱性,这与高鹏等[26]研究一致。堆肥初期含水率60%左右,堆肥产品中空白对照组35.69%,添加复合菌剂组含水率仅有22.25%,添加复合菌剂明显加快微生物代谢,促进了堆肥含水率的下降,这与李再兴等[27]研究一致。种子发芽率达到80%以上,说明堆体的腐熟程度符合标准。该研究中自制菌剂组的发芽率比空白组提升了5百分点,表明添加外源菌剂能提高堆肥发芽率,这与高鹏等[26]研究一致。徐杰等[8]利用多重筛选的方法,从各种环境中筛选出4株高效纤维素降解菌,提高了18.86%的纤维素降解率同时减少了NH3高于42%损失率,在转化纤维素的同时达到了固氮的作用。该研究针对性地对纤维素、淀粉、油脂降解菌株进行筛选,有助于提高降解率。

4 结论

(1)从不同样品中筛选出XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分别为海洋芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌,且彼此间无拮抗作用,无致病性与毒性,可用于复合菌剂制备。

(2)为使复合菌剂的效果达到最佳,以有效活菌数作为响应值进行响应面优化,根据单因素试验结果,通过 PB 试验设计得到影响最显著的4个因素,分别为葡萄糖添加量、氮源添加量、pH、接种量。通过BBD试验设计得到最佳培养条件为 pH 为7.4,氮源添加量为7.8 g/L,接种量为8%,葡萄糖添加量为4.5 g/L,经试验验证得到平均有效活菌数为6.090×109CFU/g,验证试验拟合性良好。

(3)将优化后的菌剂进行实际猪粪堆肥试验,发现由3株菌株复合而成的复合菌剂可以加快猪粪好氧堆肥的进程,延长堆肥高温期的时间,综合来讲提高了堆肥产品的品质,在猪粪堆肥的无害化和资源化方面具有一定的应用潜能。