核酸扩增技术检测circRNA研究进展

王 刚 许 艳 高雪芹

1. 山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）肿瘤中心，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有共价闭环结构的RNA分子，在真核生物细胞中广泛表达，且参与多种生命活动的调控［1-2］。研究发现，circRNA 可以作为“海绵”吸附相应的小分子RNA（microRNA, miRNA），从而调节疾病的进展［3-4］。最近的研究发现，circRNA 也可以直接与信使RNA（messenger RNA， mRNA）作用，通过募集RNA结合蛋白的来增加mRNA的稳定性，并促进其翻译［1］。另有研究发现，有些circRNA 也具有指导多肽翻译的潜质［5］。

circRNA在生物体内相对稳定的环状结构和重要生物调节作用逐渐受到研究者的重视，有望成为临床疾病诊断的新型指标。目前，检测circRNA的方法有RNA 测序（RNA-Seq）［6-7］，RNA 印记技术（northern blotting）［8］，微型矩阵［9］和以核酸扩增为基础的检测方法（PCR和等温扩增技术）［10］。RNA测序流程相对复杂，需要昂贵的仪器和专业的人员分析检测结果［11］；微型矩阵更适合circRNA定性检测［9］；RNA印记技术灵敏度较低，且操作复杂［12］，而核酸扩增为基础的检测方法操作相对简单，且能定量检测circRNA，最有可能成为临床circRNA检测技术。本文主要总结、比较以核酸扩增为基础的circRNA 检测方法（详见表1），以期为circRNA的检测提供理论依据。

表格1 以核酸扩增为基础检测技术检测circRNA的比较

1 PCR

1.1 实时定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction， qRT-PCR）

研究circRNA 表达变化时， qRT-PCR 是最常用的方法，其重复性高、检测灵敏［13］，是circRNA 定量检测的“金标准”。使用qRT-PCR 检测circRNA 时，首先提取细胞或组织中的总RNA，接下来用核糖核酸酶R（ribonuclease R， RNase R）水解掉线性的RNA，然后逆转录获取cDNA，PCR 检测cDNA 浓度［20］。检测、确认circRNA时，关键是验证引物的设计，其引物设计的原则和其他核酸序列引物设计原则一致，比如引物长度为20 nt 左右，Tm 为58 ℃ ～60 ℃，产物长度120 ～ 200 nt［13］。但是，与其他线性RNA 检测相比，还需要增加成环的验证，因此circRNA 引物设计时需要将引物设计在连接点两侧，其PCR产物里包括了首尾相接的连接点［21］。

相应circRNA 验证引物设计需要以下几个步骤［21］，①查找circRNA 的碱基序列：在“UCSC genome browser（https：//genome.ucsc.edu/）”查找相应circRNA 序列；②模板准备：将circRNA 序列3'末端100 nt 碱基序列加到5'末端的100 nt 的序列上；③引物设计：利用Primer 3或者NCBI primer-BLAST设计引物，最终PCR产物包含120 ～ 200 nt碱基。

目前，qRT-PCR 是circRNA 定量检测重复性最好的方法，但是在检测过程中也会存在一些缺点。首先，与线性RNA 相比，circRNA 在相应细胞或组织里的浓度较低，不利于其定量［22］。其次，qRTPCR 检测需要RNase R 水解线性RNA，但在此过程中可能无法水解具有二级结构的线性RNA。另外，RNase R也可水解分子量较大的circRNA，给最终结果带来较大的误差［8］。更重要的是，在逆转录的过程中，1 个circRNA 分子可能产生多个cDNA，可使最终的结果偏高［23］。

1.2 微滴数字逆转录PCR（droplet digital PCR，ddPCR）

为了克服RT-PCR 中的缺点，李天文等［24］采用ddPCR 技术检测胃癌相关的circRNA。ddPCR 技术是近些年开发的第三代PCR技术，可对目标核酸分子进行定量检测。结合流体技术和乳化化学，样品被分成成千上万纳升大小的液滴，每个液滴都支持单端点PCR扩增。最后，根据泊松算法，计算出原始样本中目标核酸的绝对含量［25］。与常规定量PCR相比，ddPCR耗时，成本较高，但其定量不依赖标准曲线或者Ct值，定量更加准确［26］。

目前，ddPCR 应用在临床、食品、饲料等多方面，可以用于细菌、病毒、基因突变和甲基化等的检测［27-30］。其检测目标样品时包括了多个检测步骤，主要为样品准备、液滴准备、PCR 扩增、液滴统计、数据分析，具体的操作流程如下［31］：①准备PCR 反应体系：此过程和常规PCR 类似，将反应所需要的PCR 反应液、扩增引物，待检测cDNA 混匀，注意无模板样品和阴性样品的设置。②微滴制备：将A过程中混匀的PCR 反应液加入到微滴发生器的样品孔道，与此同时油性乳浊液也注射到微滴发生器中的油孔道，随后将其放入微滴产生仪中，使PCR 反应液和乳浊液混合。③PCR反应：将油水混合液移到96 孔板中，预热后进行PCR 反应。④数据统计：PCR反应结束后，将96孔板放入微滴计数仪中分析结果。

1.3 连接酶-PCR

2020 年，Zhang 等［10］建立了连接酶-PCR 技术特异检测circRNA。此方法具体检测原理和过程如下：针对circRNA 反向剪接连接点两侧的序列设计探针（探针A 和B），每一条探针包括了引物特异性序列和circRNA 特异性识别序列。检测相关circRNA时，首先时是探针和待检测目标杂交，接下来splintR 连接酶作用于杂交产物。如果待检测目标是相关circRNA，会产生DNA 模板，启动PCR 反应，反之最后无法进行PCR 扩增。连接酶-PCR 能够定量检测circRNA，可以跨5 个梯度浓度对相应circRNA 定量，最低检测浓度为1 fM。这种检测方法不用进行逆转录过程，且操作简单。

2 等温扩增方法

20 世纪90 年代，等温扩增技术的出现为核酸扩增检测提供了更多的选择，其能在恒温下迅速、高效的扩增目的序列［32］。目前，等温扩增技术已经用于circRNA 的检测，近些年，人们采用滚环扩增、环介导的等温扩增等扩增技术检测circRNA，实现了circRNA的高效、低成本检测。

2.1 滚环扩增检测circRNA

滚环扩增（rolling cycle amplification， RCA）以单链环形核苷酸链为模板，以一段单链核酸（可以是待检测的miRNA 或者长核酸链）为引物，对其进行延伸扩增，最终产物里面包含了大量重复的DNA序列［33］。目前，滚环扩增是检测circRNA 使用频率最高的等温扩增技术。

2019 年，Boss 等［34］建立了检测circRNA 的RCA 平台。在该方法中以待检测circRNA 直接作为RCA 扩增的模板，针对其设计特异性扩增逆转录引物，具体的检测原理为：针对circRNA 设计特异性逆转录引物1 或者逆转录引物2，如果采用逆转录引物1 检测，circRNA 能进行逆转录滚环扩增，最终得到不同分子量大小的cDNA，而相应的线性RNA 只能产生一种分子量的cDNA。逆转录引物2 针对circRNA 反向剪接位点设计，只能扩增circRNA。2020 年，Liu 等［11］也采用了相似的思路检测建立了RT-RCA 检测circRNA，其在检测过程中针对RCA 产物设计特异性分子信标，通过荧光信号的收集判读结果。

Jiao 等［35］设计了线性DNA 纳米结构来检测circRNA，其针对RCA产物设计2个发卡状的探针1和2。在检测时，RCA 产物、检测探针1 和2 共同组成线性DNA 纳米结构，接下来相应circRNA 存在时，与探针1杂交促使2条探针构象都发生变化，从而促使探针1与探针2结合，最终产生荧光信号［35］。Dong 等［18］以网状杂交链式反应为基础，联合RCA建立了circRNA 快速检测的技术。首先，对目标circRNA 进行逆转录滚环扩增，得到RCA 产物。接下来对RCA 产物特异设计了Trigger、H1，H2 3条探针进行杂交链式反应，实现检测信号的放大。这种方法，提高了检测的灵敏度，可检测到0.1 pM 的circRNA，但是设计本身比较复杂，较难控制。

RT-RCA 检测circRNA 时可以针对反向剪接位点设计引物，不用RNaseR 消化线性RNA，实现circRNA 特异性扩增，避免了RNaseR 的影响。但是，circRNA 的分子量大小不一样，RT-RCA 是否适合不同分子量大小的circRNA进行扩增，尚需验证。

2.2 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）检测circRNA

LAMP 是2000 年由日本科学家Notomi 建立的体外核酸检测技术，其针对目的序列设计2对引物，识别目的序列的6 个区域，实现快速、高效的检测［36］。目前LAMP已经应用于各种病原菌的检测，以此技术开发的结核分枝杆菌检测试剂盒已经受到WHO的推荐，应用于临床结核的诊断［37］。2020年，Zhang等［16］针对circRNA反向连接点设计了2对茎环引物，在不需要RNaseR消化线性RNA的情况下，能实现circRNA 特异性检测，最终检测灵敏度能达到10 aM。LAMP 是目前检测circRNA 最灵敏的方法，但其容易出现非特异性扩增，导致假阳性结果［17］。

2.3 双链特异性核酸酶依赖检测方法

2018 年，Jiao 等［35］建立了可直接检测真实样品中circRNA 的技术，该技术利用了circRNA 可以吸附miRNA 的特性以及双链特异性核酸酶的优势。双链特异性核酸酶特异性的水解双链DNA 或DNA：RNA 异源双链，对单链DNA 或单链或双链RNA 没有作用。其检测选取circRNA中7个吸附位点设计相应的分子信标，分子信标两个游离端分别标记荧光集团和猝灭集团。当分子信标与目的circRNA杂交后，分子信标中的荧光集团和猝灭集团达到发光距离，样品中荧光信号增强。接下来双链特异性核酸酶能够水解DNA/circRNA复合物中的DNA部分，使荧光信号大幅度增强［19］。这种方法检测circRNA操作简单，但是需要RNase R处理样品。

3 展 望

circRNA作为临床新的靶标分子已经引起了广泛的关注，但只有少部分circRNA 作用机理已经清楚，大部分circRNA的作用还有待研究。另外，作为临床疾病的诊断指标，在临床应用时涉及到临界值的问题，即circRNA 浓度达到多少，标志疾病出现。更重要的是，虽然circRNA的检测方法较多，但各有优缺点，而临床需要稳定且灵敏的检测方式，因此circRNA的检测仍需要进一步完善。

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