‘申华’葡萄果实特征香气成分分析

奚晓军,查 倩,殷向静,蒋爱丽

(上海市农业科学院林木果树研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201403)

葡萄是世界性的重要经济果树之一,其果实酸甜可口、风味俱佳且富含多种维生素及营养成分,深受消费者的喜爱。 香气作为重要的品质性状,既丰富了葡萄果实的风味,又强化了葡萄的果实属性,是吸引消费者购买的重要指标[1]。 目前已知葡萄和葡萄酒中具有香气的挥发性化合物有1 300 多种,主要为醇类、酯类、醛类、萜烯类、酮类和C13 降异戊二烯类等物质。 然而,并不是所有检测到的挥发性物质都对葡萄果实的香味起作用,真正起决定性作用的是其中的少数特征香气物质[2]。 如玫瑰香型葡萄的特征香气主要来源于萜类化合物,尤其是单萜物质,如里那醇、香叶醇、橙花醇等[3]。 酯类物质被认为是草莓香型葡萄的特征化合物,包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、邻氨基苯甲酸甲酯等[4]。 葡萄果实中特征香气成分的鉴定主要是利用气味活性值(Odor activity value,OAV)进行,即通过计算挥发性物质的实际含量与其气味感官阈值(Sensory thresholds)的比值判断对香味的贡献程度,具有量化、简便、精确等优点,已被广泛应用于葡萄和葡萄酒特征香气成分的鉴定分析[5-8]。

‘申华’葡萄是由上海市农业科学院选育的优质新品种,具有成熟期早、色泽好、无核果粒大、风味浓郁等特征,已在上海市郊及周边地区有了一定的栽培面积和知名度[9]。 然而,与同类型‘巨峰’系品种不同的是,‘申华’葡萄成熟时在草莓香味中还含有一股浓郁的酒香,因而被戏称为“酒香葡萄”。 目前此类香型葡萄果实的关键呈香成分尚不明确。 本研究以‘申华’和‘巨峰’为试材,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测两个葡萄在成熟期时果实中的挥发性香气物质的种类和含量,并通过气味活性值及果实香气轮廓来综合分析这两个品种在活性香气成分上的差异,筛选‘申华’葡萄酒香气味形成的特征香气成分,以期为后续‘申华’葡萄更好地开发利用以及香味葡萄品种选育提供参考依据和科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2021 年在上海市农业科学院庄行葡萄试验基地进行,试验园土壤以黏土为主,20—40 cm 土层有机质含量1.79%,全氮含量0.1%,全磷含量0.17%,全钾含量7 718 mg∕kg。 葡萄果实香气检测在上海交通大学分析测试中心进行。

1.2 试验材料

以8 年生‘申华’和‘巨峰’葡萄树为试材,8 m 钢管大棚设施栽培,株行距4 m×2.8 m,采用高干篱架配合“V”形叶幕的栽培架式。 各品种成熟期随机采集5 穗生长良好、大小一致、无病虫害的果实,每穗在上、中、下部位各取葡萄果实2 粒,重复3 次。 采集的果粒迅速用液氮冷冻,-80 ℃储存备用。

1.3 试验方法

1.3.1 果实香气物质的提取

参照Xi 等[10]的方法进行果实挥发性香气物质的提取。 称取50 g 样品,剪掉果梗并去籽后用液氮研磨成粉,4 ℃、10 000 r∕min 离心10 min,取上清液待用。 取6 mL 葡萄汁,加入预装1.5 g NaCl 的20 mL 螺盖样品瓶中,再添加4 μL 内标物质2-辛醇(53.84 mg∕L),加盖密封后用于进样及GC-MS 分析。 重复3 次。

1.3.2 气相色谱条件和香气物质的定性定量分析

气相色谱-质谱联用的检测条件和香气物质定性定量分析方法参见Wu 等[5],利用全离子扫描图谱,将质谱图在NIST11 标准谱库匹配检索,并根据已有标准品的色谱保留时间和质谱信息进行定性分析。对于有标准品的化合物,利用其相应的标准曲线进行定量,没有标准品的化合物,使用内标进行半定量。

1.3.3 气味活性值(OAV)和果实香气轮廓

通过查阅文献确定各香气化合物的相关描述和感官阈值,利用各成分的定量结果与感官阈值的比值计算OAV,OAV≥1 即定性为具有贡献的活性香气成分。 根据化合物的香气描述共分为植物类、花香类、果香类、脂肪类等8 个香系,通过对应香系的活性香气成分的OAV 累计值进行果实香气轮廓分析,当活性香气成分对应多个香味系列时,每个系列均获得该OAV 值。

1.4 数据分析

采用Excel 2017 软件对数据进行统计整理和作图,采用SPSS 18.0 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 ‘申华’和‘巨峰’葡萄果实香气的定量分析

由表1 可知,‘申华’葡萄果实中共检测到42 个香气化合物,包括C6 化合物6 个、醇类5 个、酯类14 个、醛类12 个、萜烯类5 个。 ‘巨峰’葡萄果实中共检测到香气化合物37 个,包括C6 化合物6 个、醇类4 个、酯类15 个、醛类11 个、萜烯类1 个。 其中有6 个化合物仅在‘申华’中能检测到,主要为萜烯类化合物。 而异丁酸乙酯只出现在‘巨峰’葡萄果实中。 此外,酯类化合物在两个品种中检测到的数量都是最多的,醛类次之。

表1 ‘申华’和‘巨峰’葡萄果实的香气成分含量Table 1 Content of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

如图1 所示,‘申华’和‘巨峰’葡萄均以酯类和C6 化合物为主,这两类化合物的含量之和占比达98.31%和98.81%,其中酯类含量最高,尤其是‘申华’葡萄,酯类化合物含量占比达92.78%。 ‘申华’葡萄果实中挥发性香气物质的总含量达到33 038.17 μg∕L,显著高于‘巨峰’果实中的13 826.38 μg∕L(表1)。

图1 ‘申华’和‘巨峰’葡萄果实香气成分种类占比Fig.1 Percentage of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

‘巨峰’葡萄果实中C6 化合物的总含量显著高于‘申华’,其中反式-2-己烯醛在‘申华’和‘巨峰’葡萄的含量均最高,分别为1 158.51 μg∕L 和1 190.62 μg∕L,是C6 化合物总含量的63.43%和47.53%,但两个品种间无显著性差异。 1-己醇、反式-2-己烯-1-醇在‘巨峰’葡萄中的含量显著高于‘申华’,而‘申华’中正己醛和顺式-3-己烯-1-醇的含量显著高于‘巨峰’(表1)。

醇类化合物在‘申华’和‘巨峰’果实中的含量均不高,分别为13.17 μg∕L 和8.45 μg∕L,在‘申华’中的含量明显大于‘巨峰’。 除2-乙基己醇之外,其余4 个醇类化合物在‘申华’果实中的含量均显著高于‘巨峰’。 (表1)

‘申华’葡萄果实中的酯类化合物总含量为30 652.60 μg∕L,明显大于‘巨峰’的11 156.93 μg∕L。 乙酸乙酯是两个品种中含量最高的酯类化合物,在‘申华’和‘巨峰’果实中的含量分别达到30 333.54 μg∕L和10 589.12 μg∕L,是酯类化合物总含量的98.96%和94.91%。 剩余的14 个酯类化合物中,丁酸乙酯的含量较高,在‘申华’和‘巨峰’中的含量分别为161.42 μg∕L 和312.98 μg∕L,两者差异显著。 在所有检测到的酯类化合物中,有8 个化合物在‘申华’中的含量显著高于‘巨峰’,4 个化合物含量显著低于‘巨峰’(表1)。

‘申华’和‘巨峰’在醛类化合物含量上同样差异显著,其中3-甲基丁醛是含量较高的化合物,在‘申华’和‘巨峰’中的含量分别为333.18 μg∕L 和79.78 μg∕L,是醛类化合物总含量的65.42%和51.54%。其他11 个醛类化合物中,有8 个在‘申华’中的含量明显高于‘巨峰’,因此,‘申华’果实中的醛类化合物总含量显著高于‘巨峰’(表1)。

萜烯类物质在两个品种中的含量均极低,尤其是‘巨峰’,其含量仅为1.34 μg∕L。 在‘申华’葡萄中检测到的5 个萜烯类化合物,仅对伞花烃在‘巨峰’葡萄果实中也能检测到,且含量显著低于‘申华’(表1)。

2.2 ‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实活性香气成分

由表2 可知,在两个品种中共有21 个化合物被认定为活性香气成分,包括5 个C6 化合物、1 个醇类化合物、7 个酯类化合物以及8 个醛类化合物,其中‘申华’和‘巨峰’葡萄中的活性呈香成分数量均为19个。 此外,活性香气成分的OAV 值在两个品种间存在差异,其对果实香气的贡献也不同。 C6 化合物中主要的活性香气成分包括反式-2-己烯醛、3-己烯醛和正己醛,是植物类气味的重要贡献成分。 其中‘申华’葡萄中的反式-2-己烯醛和正己醛的OAV 值高于‘巨峰’,而3-己烯醛的OAV 值低于‘巨峰’。 两个品种醇类化合物中仅1-辛烯-3-醇的OAV 值≥1,其在‘申华’葡萄中的OAV 值高于‘巨峰’,对植物类和脂肪类气味都有贡献,而其他醇类化合物均不是活性香气成分。 酯类化合物是果香类气味的主要贡献成分,其中,2-甲基丁酸乙酯虽然在两个品种中的含量均不高,但由于其极低的阈值使得它在‘申华’和‘巨峰’中的OAV 值分别达到107.14 和82.52,是最重要的果香类气味贡献成分。 而乙酸乙酯虽然在两个品种中的含量极高,但由于其感官阈值高达5 000 μg∕L,使得OAV 值在‘申华’和‘巨峰’分别只有6.07 和2.12,对果实整体的香气贡献不大。 己酸乙酯是另一个对果香类气味有较大贡献的酯类物质,其在‘申华’和‘巨峰’中的OAV 值分别为41.91 和71.84。 值得一提的是,‘巨峰’果实中戊酸乙酯的OAV 值为83.14,远高于‘申华’中的10.97,但是戊酸乙酯只对植物类气味有贡献。 醛类化合物的感官阈值普遍较低,因此,两个品种中的醛类活性香气成分较多。 这些成分在‘申华’中的OAV 值均大于‘巨峰’,而且对植物类、果香类、脂肪类以及花香类气味都有贡献。 萜烯类化合物在‘申华’和‘巨峰’葡萄中的OAV 值均小于1,对这两个品种果实的整体香气均无贡献。

表2 ‘申华’和‘巨峰’葡萄活性香气成分气味活性值(OAV)Table 2 Odor activity value of active aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

2.3 ‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实香气合成途径分析

由表3 可知,‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实香气合成均以脂肪酸途径为主,其合成香气含量分别占香气总含量的98.57%和99.23%。 ‘申华’果实中通过脂肪酸途径合成的香气含量为32 564.87 μg∕L,显著高于‘巨峰’的13 720.55 μg∕L,其中含量较高的香气物质主要为反式-2-己烯醛、1-己醇、乙酸乙酯等直链脂肪族醇、醛和酯类物质。 在‘申华’和‘巨峰’中通过氨基酸途径合成的香气物质分别有9 个和8 个,主要是2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛等支链脂肪族醛和酯类物质,这些香气物质在‘申华’中的含量为446.29 μg∕L,显著高于‘巨峰’中的105.83 μg∕L。 相比脂肪酸途径,氨基酸途径合成的香气物质在这两个葡萄品种中的含量都不高,但代谢形成了一些重要的呈香活性成分,尤其是2-甲基丁酸乙酯,对‘申华’和‘巨峰’葡萄果香类气味有着重要的贡献。 因此,氨基酸途径是‘申华’和‘巨峰’葡萄果实香气形成的重要方式。 ‘申华’葡萄果实中通过异戊二烯途径合成的香气含量仅为27 μg∕L,且不存在萜烯类的活性香气化合物,而在‘巨峰’果实中甚至都没有检测到相关的香气物质,所以异戊二烯合成途径对这两个品种果实香气物质形成贡献可忽略。

表3 ‘申华’和‘巨峰’果实香气物质合成途径分析Table 3 Biosynthetic pathway of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

2.4 ‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实香气轮廓分析

如图2 所示,‘申华’和‘巨峰’葡萄在果实香气轮廓上存在一定差异。 植物类和果香类气味是两个品种果实共同的主要特征,‘申华’葡萄中植物类气味强度为443,略高于‘巨峰’中的372。 果香类气味强度在‘申华’和‘巨峰’果实中分别为294 和200。 脂肪类气味是两个品种的次要特征,其在‘申华’葡萄果实中的强度为131,明显高于‘巨峰’中的68,而剩余的其他气味系列如香料类、溶剂类等在两个品种中的强度极低或无。 因此,‘申华’葡萄的整体气味强度要高于‘巨峰’。

图2 ‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实香气轮廓Fig.2 Aroma profiles of ‘Shenhua’and ‘Kyoho’ grapes

3 讨论与结论

香气是鲜食葡萄风味形成的重要组成部分,也是衡量果实品质的重要指标。 研究表明,不同葡萄品种果实中的香气成分和含量存在很大的差异[3]。 C6 化合物是葡萄果实中最重要的香气组分,被认为是所有葡萄品种中的基础性香气物质[27]。 陈迎春等[28]通过对6 个鲜食葡萄品种的挥发性香气物质进行比较,发现C6 化合物在成熟果实中的含量很高,是贡献最大的挥发性化合物。 牛早柱等[29]研究发现,2-己烯醛和己醛等C6 化合物在15 个鲜食葡萄品种中的相对含量和香气值均较高,是对葡萄果实香气影响较大的物质。 李凯等[7]对‘醉金香’和‘香玉’葡萄的香气成分进行分析,发现反式-2-己烯醛、正己醛等C6 化合物的含量较高,是两个品种植物类气味的重要贡献化合物。 本研究通过分析比较‘申华’和‘巨峰’葡萄的香气成分,同样发现反式-2-己烯醛、正己醛和3-己烯醛等C6化合物是这两个品种重要的活性香气物质,对植物类气味有较大贡献。

‘申华’葡萄是‘京亚’和‘86-179’的杂交后代[9],而‘京亚’和‘86-179’均是‘巨峰’的后代,因此,‘申华’也是四倍体巨峰系品种,有着‘巨峰’果实中的典型草莓香味。 研究表明,酯类化合物是草莓香型欧美杂交种葡萄的特征化合物,对葡萄果香类气味有着重要的贡献[30-31]。 张文文等[6]研究发现,丁酸乙酯是‘巨峰’葡萄果香气味的主要香气贡献化合物,而另一个巨峰系品种‘藤稔’果香显著的原因主要是2-甲基丁酸乙酯的存在。 酯类化合物异丁酸乙酯和丁酸乙酯在‘醉金香’和‘香玉’葡萄中具有高OAV 值,被认为是这两个品种果香类气味的重要贡献化合物[7]。 与前人的研究结果类似,本研究中,‘申华’和‘巨峰’葡萄果实中酯类物质的数量最多且含量最高,其中2-甲基丁酸乙酯是两个品种最重要的果香类气味的贡献成分,尤其是在‘申华’葡萄中,其OAV 值高达107.14。 己酸乙酯、丁酸乙酯等也是果香类气味的重要贡献成分,但其在‘申华’葡萄中的OAV 值都低于‘巨峰’。 乙酸乙酯在两个品种中的含量非常高,占所有酯类化合物总含量的90%以上,但由于其过高的感官阈值,使得它对果实整体的香气贡献不大,这与前人的研究结果一致[5-7]。 另外,‘申华’葡萄果实中除了具有巨峰系典型草莓香味外,还含有一股浓郁的酒香气味,本研究通过比较分析‘申华’和‘巨峰’葡萄中的活性香气成分和含量,发现酯类化合物庚酸乙酯可能是‘申华’葡萄果实酒香气味的重要贡献物质,其香味描述为葡萄酒香、白兰地香以及果香[6],而且它在‘申华’葡萄中的OAV 值显著高于‘巨峰’。

醛类也是葡萄果实中香气物质的重要组成部分,对植物类、花香类等气味均具有贡献。 研究表明,2-苯乙醛、3-甲基丁醛等醛类化合物是陈酿葡萄酒中重要的香气贡献成分[24],反式-2-壬烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛则是鲜食葡萄‘户太8 号’果实中植物类气味的重要贡献物质[32]。 本研究发现,‘申华’和‘巨峰’葡萄中的醛类活性香气成分较多,尤其是3-甲基丁醛、反式-2-壬烯醛和壬醛,在‘申华’中的OAV 值均显著高于‘巨峰’,对植物类、果香类以及脂肪类气味有重要的贡献。

萜烯类化合物是玫瑰香型葡萄的特征香气成分,在欧亚种‘玫瑰香’、欧美杂交种‘巨玫瑰’等玫瑰香型品种中能检测到数量较多且OAV 值较高的萜类化合物,其中里那醇、香叶醇等单萜类化合物对玫瑰香味的贡献最大[10,26]。 ‘申华’和‘巨峰’葡萄果实并不具备玫瑰香味,在两个品种中只检测到极少量的萜烯类化合物,OAV 分析结果也表明这些萜烯类物质对两个品种的果实香气均无贡献。 因此,萜烯类化合物不是‘申华’和‘巨峰’葡萄中的活性香气成分。

鲜食葡萄香气物质的合成主要通过脂肪酸、氨基酸和异戊二烯等代谢途径,即底物在酶的直接催化下合成挥发性物质。 葡萄果实中的C6、C9 醇和醛类及其所形成的酯主要是以脂肪酸为前体而形成,氨基酸途径产物以支链或芳香族结构为主,而萜烯类物质由异戊二烯途径合成,包括类赤霉素、胡萝卜素、甾醇等在内的单、倍半、二和多萜等组分[33]。 周建梅等[34]研究发现,‘巨峰’葡萄果实香气的合成以脂肪酸途径为主,同时氨基酸途径香气合成也占有较大比重。 在本研究中,‘申华’作为巨峰系的欧美杂交种,其果实香气合成同样以脂肪酸途径为主,推测‘申华’葡萄果实中具有较高活性的脂氧合酶参与脂肪酸氧化,进而促进酯类物质的合成。 此外,通过氨基酸途径合成的2-甲基丁酸乙酯是‘申华’葡萄最重要的果香类气味贡献成分,表明氨基酸途径也是‘申华’果实香气形成的重要方式。 葡萄果实香气的合成与积累是一个极为复杂的过程,大量研究表明,果实的怡人香气不只是由其遗传特性决定,还受到环境因子、栽培措施等多种因素的影响[31,34-36]。 因此,针对‘申华’果实香气成分的生物合成及其变化的调控技术还有待进一步深入研究,从而更好地助推‘申华’葡萄的开发利用。

综上,‘申华’和‘巨峰’葡萄果实中分别发现42 个和37 个香气物质,主要以酯类和C6 化合物为主,其中酯类含量极其突出,尤其是在‘申华’葡萄中,占总含量的92.78%。 除了C6 化合物之外,其他酯类、醛类等化合物在‘申华’中的含量均显著高于‘巨峰’。 OAV 结果明确‘申华’和‘巨峰’葡萄均有19 个活性香气成分,反式-2-己烯醛、正己醛和3-己烯醛等C6 化合物是这两个品种重要的活性香气物质,对植物类气味有较大的贡献。 2-甲基丁酸乙酯是‘申华’葡萄最重要的果香类气味的贡献成分,‘巨峰’则是2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯。 香气描述发现庚酸乙酯可能是‘申华’葡萄果实酒香气味的重要贡献成分。3-甲基丁醛、反式-2-壬烯醛和壬醛是植物类、果香类以及脂肪类气味的重要贡献成分,尤其是在‘申华’中,其OAV 值显著高于‘巨峰’。 果实香气合成途径分析显示,‘申华’和‘巨峰’葡萄的果实香气合成均以脂肪酸途径为主,同时氨基酸途径在香气合成中也发挥着重要的作用。 果实香气轮廓直观地表明植物类和果香类气味是两个品种果实共同的主要特征,而‘申华’葡萄果实整体气味强度高于‘巨峰’。