马铃薯PAL基因家族的全基因组鉴定及其在非生物胁迫下和块茎花色素苷合成中的表达分析

2023-09-14朱金勇曾钰婷李志涛陈丽敏李泓阳史田斌张俊莲白江平刘玉汇

作物学报 2023年11期

朱金勇刘震曾钰婷李志涛陈丽敏李泓阳史田斌张俊莲白江平刘玉汇,*

朱金勇1刘震1曾钰婷2李志涛1陈丽敏1李泓阳1史田斌1张俊莲3白江平1刘玉汇1,*

1甘肃农业大学农学院/ 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室(甘肃农业大学) / 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃兰州 730070;2西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所, 西藏拉萨 850032;3甘肃农业大学园艺学院, 甘肃兰州 730070

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)是苯丙烷代谢途径的限速酶和关键酶, 在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究在马铃薯(L.)全基因组水平下, 利用BlastP和HMM 3.1鉴定到8个PAL基因家族成员, 利用ExPASy、CELLO、PlantCARE等在线工具, 对PAL基因家族成员的进行生物信息学分析。利用PGSC数据库下载的RNA-seq数据, 分析了在双单倍体(DM)马铃薯不同组织部位和非生物胁迫下的表达模式。对3个不同颜色马铃薯块茎组织(皮和肉)进行RNA-seq, 以及利用3个不同颜色块茎杂交子代的薯肉进行qPCR分析。结果表明, 8个分布在3、5、9和10号染色体上, 它们与烟草() PAL的亲缘关系较近。基因成员的启动子区域内含有多个顺式元件, 包括光响应、逆境胁迫响应、激素响应、生长发育相关和转录因子调控的多种顺式元件。在匍匐茎中特异表达,在块茎和匍匐茎中特异表达,在甘露醇处理下下调表达,和在热胁迫中上调表达。它们可能参与了马铃薯块茎的发育和非生物胁迫响应。5个()基因在彩色薯肉中均上调表达, 可能参与马铃薯薯肉中花色素苷的生物合成。这些结果为进一步了解StPAL基因家族特征, 深入分析基因在马铃薯中的功能提供了理论依据。

马铃薯; PAL基因家族; 非生物胁迫; 花色素苷生物合成; 表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是苯丙烷类代谢途径起始反应中的关键酶和限速酶。该反应以L-苯丙氨酸作为底物, 在PAL的催化下发生脱氨反应, 形成数种多酚化合物的前体, 如木质素、花色素苷和植保素等[1-2]。已有研究表明, 这些次生代谢产物具有多种生物功能, 不但参与植株的生长发育[3-4]、色素生物合成[5-6], 在植株响应生物[7-8]和非生物胁迫[9-12]方面也发挥着重要的作用。

1961年, Koukal和Conn[13]首次从大麦()中分离提取了PAL蛋白, 它是初生代谢和苯丙烷代谢途径的纽带, 对植物有非常重要的生理意义。在拟南芥()中,和同时缺失突变会使木质素和花青素含量减少导致植株发育迟缓[14]。Olsen等[15]研究发现在拟南芥响应缺氮胁迫和低温胁迫中也发挥着作用。李元等[16]研究发现, 水稻()受到UV-B辐射和稻瘟病菌胁迫后, 会诱导苯丙氨酸解氨酶活性上升, 类黄酮含量显著增加, 从而增强抗性。在烟草()中,的表达显著受到NaCl、甘露醇和低温处理诱导,可能在烟草响应非生物胁迫和抗氧化信号转导中发挥调节作用[17]。杨会晓等[18]发现, 香蕉()大部分PAL成员不但响应低温、干旱和盐胁迫, 还参与了果实的发育。在苹果()中研究发现, PAL通过调节类黄酮等物质的含量参与调控果实的生长发育和成熟[19]。

马铃薯(L)是仅次于水稻()和小麦()的第三大粮食作物[20], 因其耐贫瘠、适应性广、高产稳产等特点在世界范围内广泛种植。马铃薯块茎含有丰富的营养成分, 包括淀粉、糖和蛋白质, 以及多种抗氧化剂, 如多酚、维生素C、类胡萝卜素、硒[21]等。彩色马铃薯不仅含有普通马铃薯的营养物质, 还拥有丰富的花青素[22]。花青素不但在植物的生长发育中参与许多生物学过程, 如使花器官具有特定的颜色来吸引传粉者[23]、花粉管萌发[24]和适应紫外线辐射[25]等, 而且在植株响应非生物胁迫方面也发挥着重要作用[26-27]。此外, 研究发现花青素具有较强的抗氧化性和清除自由基的能力, 在预防心血管疾病、控制肥胖、缓解糖尿病、保护肝脏、抗炎症反应、抗病毒和抗癌等方面具有一定功效, 备受人们的关注[28-30]。

在马铃薯的实际生产中, 块茎的产量受到多种生物和非生物胁迫的影响, 如病虫害、高温、盐胁迫和干旱胁迫等, 它们严重制约着马铃薯产业的发展。目前, PAL基因家族在多种作物中已有报道[31-33], 研究表明大量的PALs参与了植物对病原菌、蚜虫、冷、热、盐和干旱等胁迫的响应[7-12,34], 但关于马铃薯PAL基因家族的研究尚未见报道。

本研究在马铃薯全基因组水平下共鉴定了8个PAL基因家族成员, 对其分子特征、基因结构、蛋白保守结构域进行分析, 并利用PGSC数据库下载的RNA-seq数据, 分析基因在双单倍体(doubled monoploid, DM)马铃薯不同组织部位、非生物胁迫处理下的表达模式。选用3个不同颜色马铃薯块茎组织 (皮和肉)进行RNA-seq测序, 分析了8个在不同颜色块茎组织中的表达, 并利用qPCR技术, 进一步分析了在3个不同颜色杂交子代薯肉中的表达水平, 鉴定了可能参与花色素苷生物合成的基因。这些结果为进一步了解马铃薯PAL基因家族的特征, 探究其生物功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

1.1.1 3个不同颜色马铃薯块茎(薯皮和薯肉)

以‘新大坪’ (XD, 白皮白肉)、‘黑美人’ (HM, 紫皮紫肉)、‘铃田红美’ (LT, 红皮红肉)为试验材料(图1), 种植于甘肃省定西市农业科学研究院试验基地。待块茎成熟后, 每个品种取6个新鲜块茎(直径4～5 cm), 用蒸馏水洗净, 在至少距离薯皮组织10 mm处取薯肉组织, 利用手术刀片仔细分离块茎的薯皮(Skin, S; 约20 g)和薯肉(Flesh, F; 约50 g)组织并取样, 所取样本为1个生物学重复, 共3个生物学重复。取样后立即用液氮冷冻, 并存放在-80℃冰箱待用。

1.1.2 3个马铃薯杂交子代品系试验材料种植于甘肃省定西市农业科学研究院试验基地, 3个马铃薯品系从北方学院引进(北方学院引自国际马铃薯中心), 分别为白皮黄肉的CIP 302281.17、红皮红肉的CIP 302281.25和紫皮紫肉的CIP 302281.15, 命名为Y、R和P (亲本: 388611.22 (C91.612) × Adg purple flesh bulk)。3个杂交子代在生育时期块茎颜色(图2)。在块茎形成期(S1)和块茎成熟期(S2)取3个品系的薯肉 (取样标准同上), 共计18个样本, 样品液氮速冻后储存在-80℃冰箱保存。

1.2 马铃薯PAL基因家族成员鉴定及蛋白理化性质分析

从国际马铃薯基因组测序协会PGSC (Potato Genome Sequencing Consortium, http://spuddb. uga.edu/)下载马铃薯的蛋白质和核苷酸序列(PGSC_ DM_v4.03)。根据文献报道的基因登录号, 在TAIR网站 (http://www.arabidopsis.org/)下载了4个的基因序列和蛋白序列[36]。本文采用了2种方法来鉴定马铃薯PAL成员: (1) 从Pfam网站下载的PAL结构域序列 (PF00221), 使用HMMER 3.1软件在马铃薯蛋白数据库中搜索含PAL结构域的序列。(2) 利用拟南芥4个PAL氨基酸序列, 在马铃薯蛋白数据库进行BlastP搜索(E值≤1e–5), 查找PAL成员。然后, 将2种方法的搜索结果合并, 删除冗余序列, 将候选成员提交到SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI保守域数据(CDD)中手动筛选, 去除不包含PAL结构域的序列, 最终筛选得到马铃薯PAL基因家族成员。利用在线网站ExPasy (http://web. expasy.org/protparam/)[37]分析StPAL的蛋白氨基酸数量、分子量(molecular weight, MW)、理论等电点 (point isoelectric, pI), 利用CELLO (http://cello.life. nctu.edu.tw/)[38]预测StPAL的亚细胞定位。

图2 3个马铃薯杂交子代的块茎表型

1.3 StPALs的进化分析

使用MEGA7.0软件构建了马铃薯、拟南芥[36]、烟草[39]、葡萄[33]、水稻[40]、毛果杨[41]、香蕉[18]和大豆[42]的系统进化树, 来探究多物种PAL蛋白的进化关系, 采用Neighbor-Joining法, 参数设置: 校验参数Bootstrap重复1000次, 模式为p-diastance model, 缺口设置为partial deletion[43]。同时, 使用MEGA7.0构建了8个StPAL成员的系统进化树。

1.4 StPALs序列分析和结构特征

采用在线网站MEME程序(http://meme-suite. org/tools/meme)对StPAL保守蛋白基序进行分析, 参数设置如下: 最大基序数为10, 最佳基序宽度为6～50个氨基酸残基, 其余参数为默认值[44]。利用Gene Structure Display Server (GSDS 2.0, https://gsds. cbi.pku.edu.cn/)绘制成员的外显子和内含子结构[45]。

1.5 StPALs基因启动子序列分析

从马铃薯基因组测序协会中检索到基因转录起始位点的上游2000 bp区域, 并通过PlantCARE在线数据库(http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)[46]分析基因启动子区域的顺式作用元件。

1.6 RNA提取和实时荧光定量PCR

采用RNA提取试剂盒(天根DP419)提取总RNA,并利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-2000 (Nanodrop Technologies, 美国)分光光度计检测RNA的完整性和浓度。使用带有gDNase的快速RT试剂盒 (天根KR116)进行基因组DNA污染的消除和第一链cDNA的合成。使用天根的SuperReal PreMix Plus (SYBR Green FP205)试剂盒在CFX96 (Bio-Rad, 美国)上进行qPCR, 采用3次生物学重复。反应体系为20 μL: 2 μL cDNA (50 ng μL–1)、上下引物(10 μmol L–1)各0.6 μL、2×SYBR Green Master Mix 10 μL、ddH2O 6.8 μL。qPCR条件为: 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环; 65～95℃条件下检测熔点曲线。以(AB061263)作为内参基因[47], 用2–ΔΔCt法计算基因的相对表达量[48], 使用Origin 2021绘图。由生工生物工程 (上海)股份有限公司设计并合成引物, 引物名称及序列详见表1。

1.7 StPALs在马铃薯中的表达分析

利用PGSC下载的Illumina RNA-seq数据, 分析双单倍体马铃薯中的基因在不同组织(叶、根、芽、块茎、萼片、雄蕊、匍匐茎、成熟花、叶柄、花瓣、心皮、愈伤组织、成熟果实和未成熟果实)中和非生物胁迫下(盐处理: 150 mmol L–1NaCl, 24 h; 甘露醇处理: 260 µmol L–1甘露醇, 24 h; 热处理: 35℃, 24 h)的表达模式[49]。使用TBtools软件绘制表达热图[50]。

为进一步了解StPAL基因家族在不同颜色块茎中的表达模式, 本研究对3个不同颜色马铃薯块茎组织 (薯皮和薯肉)进行了高通量测序, 分析8个在不同颜色块茎组织中的表达, 并利用qPCR技术, 进一步分析在3个不同颜色杂交子代薯肉中的表达水平。由北京百迈客生物科技有限公司完成RNA-seq文库的构建和测序。测序完成后将结果提交于NCBI (PRJNA541919)。

表1 qPCR引物序列

PG: PGSC0003DMG40.

2 结果与分析

2.1 StPALs的鉴定及相应蛋白的特性分析

利用HMM 3.1和BlastP初步筛选了StPAL基因家族候选成员, 通过SMART和NCBI (CDD)手动删除了不包含PAL结构域的候选成员, 最终获得了8个StPAL基因家族成员。它们分布在3号、5号、9号和10号染色体上。根据基因在染色体上的物理位置分布将得到的StPALs成员进行命名, 按顺序命名为～。通过理化性质分析表明, StPAL蛋白长度在391～722 aa之间, 分子量为43.55～78.49 kD, 理论等电点为5.41～6.62。亚细胞定位预测结果表明, 除StPAL7定位在叶绿体中, 其他成员均定位在细胞质中(表2)。

表2 StPAL基因家族理化性质及亚细胞定位

2.2 StPALs的进化分析与分类

为了解StPAL基因家族的进化关系, 将8个物种共63个PAL蛋白序列进行了多重比对并构建系统发育进化树。由图3可知, 63个PALs分为6个类群(CI～CVI), 每个类群分别含有4、9、14、7、12和15个PALs。8个马铃薯StPALs均属于在CIII类群, 与其分在同一类群的还有4个烟草PAL成员(NtPAL1/2/3/4)和2个拟南芥的PAL成员(AtPAL3和AtPAL4)。表明, 马铃薯PAL基因家族成员与同为茄科的烟草亲缘关系较近, 与其他双子叶和单子叶植物亲缘关系相对较远。

2.3 StPALs的基因结构与Motif分析

为了解StPAL基因家族成员的基因结构, 本研究分析了他们的外显子和内含子结构。由图4可知, 8个具有相似的基因结构, 其中2个基因(/)不含内含子, 其余6个只含1个内含子。使用MEME在线程序, 进一步分析了StPALs蛋白的保守结构, 确定了10个保守基序, 将10个基序命名为motif1～motif10。motif2、motif1、motif6、motif3、motif10和motif4是8个StPALs蛋白所共有的; motif7和motif9存在于6个StPALs蛋白中(除StPAL1和StPAL4)。本研究还发现motif7、motif9、motif5、motif2、motif8、motif1、motif6可以构成完整的PAL结构域, 其中motif7和motif9位于C端, motif1和motif6位于N端。

2.4 StPALs顺式作用元件分析

为进一步研究基因启动子区域的顺式作用元件, 本研究通过PlantCARE在线网站分析了转录起始位点上游2000 bp的序列。分析结果显示(图5), 在启动子区域除了常见的元件TATA- box、CAAT-box外, 还发现了21种其他顺式作用元件, 这些元件与光响应、植物激素响应、逆境胁迫响应以及生长发育相关。这些顺式元件中, 有10种光响应元件 TCT-motif、G-box和GT1-motif等), 2种与逆境胁迫相关的顺式作用元件(干旱胁迫响应元件MBS、防御和胁迫响应元件TC-rich repeats), 3种激素信号传导途径相关的元件(脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element和生长素响应元件AuxRR-core), 2种与生长发育相关的元件(HD-Zip和CAT-box)以及4个与MYB、MYC、WRKY转录因子有关的顺式元件。

图3 多个物种中PALs蛋白进化树

红色圆表示StPALs, 绿色五角星表示AtPALs, 绿色六边形表示NtPALs。

The red circles represent StPALs, the green pentagrams represent AtPALs, and the green hexagons represent NtPALs.

图4 StPALs基因家族的进化关系、基因结构和保守基序分析

A: StPALs进化树。B:基因的外显子/内含子结构。蓝色框表示外显子, 相同长度的黑线表示内含子。上游/下游区域红色方框表示。C: StPALs中保守基序的分布。不同颜色的框代表10个不同的基序。

A: StPALs evolutionary tree. B: the exon/intron structure of. The blue boxes represent exons, and the black lines of the same length represent introns. The upstream/downstream area is indicated by a red box. C: the distribution of conserved motifs in StPALs. Different colored boxes represent 10 motifs.

2.5 StPALs在马铃薯不同组织中的表达分析

利用在PGSC网站中下载的RNA-seq数据, 分析了在二倍体马铃薯(DM)不同组织(未成熟果实、成熟果实、心皮、花瓣、愈伤组织、叶柄、花、匍匐茎、雄蕊、萼片、块茎、芽、根和叶)中的表达模式。分析结果表明(图6-A), 3个(//)在所有组织中表达量相对较高(FPKM> 5)。一些在个别组织部位中特异表达, 如在愈伤组织中特异表达(FPKM>60);在匍匐茎中特异表达(FPKM>80); 3个(StPAL3/5/8)在块茎和匍匐茎中特异表达(FPKM> 180);在块茎、匍匐茎、花瓣和愈伤组织中均特异表达(FPKM>350);在雄蕊中特异表达(FPKM>450)。

图6 StPALs在不同组织部位(A)、非生物胁迫(B)和不同薯皮薯肉(C)中的表达

A: 对8个基因表达量取以2为底的对数, 用log2FPKM绘制色标。B: 在3种非生物胁迫(盐、甘露醇和热胁迫)中使用处理比对照的比值, 取以2为底的对数, 用log2FC绘制色标。C: 在不同薯皮薯肉中使用彩色品种/白色品种的比值, 取以2为底的对数, 用log2FC绘制色标。XDS、LTS和HMS分别代表“新大坪”、“铃田红美”和“黑美人”的薯皮。XDF、LTF和HMF分别代表“新大坪”、“铃田红美”和“黑美人”的薯肉。

A: the relative expression level of 8is taken as the logarithm with base 2, and the color scale is plotted using the log2FPKM of each gene. B:in the three abiotic stresses (salt, mannitol, and heat stress), the ratio of treatment to control is used. The logarithm based on 2 was taken, and the color scale is drawn with log2FC. C: the ratio of color cultivar/white cultivar in different potato skins and meat, take the logarithm based on 2, and draw the color scale with log2FC. XDS, LTS, and HMS represent the potato skins of “Xindaping”, “Lingtianhongmei”, and “Heimeiren”, respectively. XDF, LTF, and HMF represent the potato fleshes of “Xindaping”, “Lingtianhongmei”, and “Heimeiren”, respectively.

2.6 StPALs在非生物胁迫下的表达模式

为探究在非生物胁迫下的响应, 本研究利用PGSC下载的RNA-seq数据分析了在盐胁迫(150 mmol L-1NaCl, 24 h)、甘露醇处理(260 µmol L-1, 24 h)和热胁迫(35℃, 24 h)下的表达模式。结果表明(图6-B), 分别有1个和2个在甘露醇处理和热胁迫下差异表达(FPKM>1和|log2(FC)| >1), 其中在甘露醇处理下差异表达下调,和在热胁迫中上调表达; 而在盐胁迫下, 8个均未差异表达。

2.7 StPALs在不同颜色块茎组织(薯皮和薯肉)中的表达分析

为验证RNA-seq数据的可靠性, 本研究对8个基因进行qPCR分析。结果发现, qPCR结果与RNA-seq数据之间虽然存在一定差异, 但整体趋势一致。通过线性回归分析得到彩色马铃薯品种RNA-seq数据与qPCR的回归方程为=0.9719+ 0.7672 (2=0.833) (图7), 说明qPCR结果与RNA-seq之间具有较好的相关性, RNA-seq数据真实可靠。

2.8 3个杂交子代马铃薯薯肉qPCR验证

为进一步分析与马铃薯块茎花色素苷生物合成的关系, 本研究利用qPCR技术, 分析了8个在遗传背景差异较小的3个不同颜色杂交子代薯肉中的表达水平(图8)。结果表明, 1个()在块茎形成期R和P中的表达显著(<0.05)高于Y; 4个()在块茎形成期(S1)和成熟期(S2)的R和P中的表达水平均显著(<0.05)高于Y; 3个()在Y、R和P薯肉中均不表达。整体来看,在3个杂交子代(Y、R和P)和3个不同品种薯肉(XDF、LTF和HMF)中的表达规律非常相似, 如在LTF和HMF中差异表达的5个()在R和P中的表达水平也显著(<0.05)高于Y, 差异表达倍数在3.81～159.20倍之间, 而在LTF和HMF中低表达或不表达的2个()在R、P和Y中均不表达。与之不同的是, 在HMF中差异表达的, 在Y、R和P的薯肉均不表达, 说明在HMF中差异表达可能与品种的特性有关。

3 讨论

在植物基因组进化中, 基因组重复、片段重复和串联重复是新基因家族成员和功能扩展的主要驱动力[51]。AtPAL基因家族可分为2个亚族,属于1个亚族,属于另1个亚族, 这种2+2方式可能是基因复制的结果[52]。本研究中共发现8个StPAL基因家族成员, 分别分布在4条染色体(Chr3、Chr5、Chr9和Chr10)上, 它们均和AtPAL3/4分在同一类群, 说明8个StPALs可能与拟南芥AtPAL3/4的亲缘关系更近, 并且StPAL基因家族成员数量是拟南芥的2倍, 这可能是由于在马铃薯的进化中发生了基因组的复制。

(图7)

对8个在白色和彩色薯皮和薯肉中的表达进行了qPCR分析。XDS、LTS和HMS分别代表“新大坪”、“红美”和“黑美人”的薯皮。XDF、LTF和HMF分别代表“新大坪”、“铃田红美”和“黑美人”的薯肉。数据为3个独立生物重复的平均值(±SE)。条形图上方的不同字母表示< 0.05时的显著差异。

The relative expression pattern of 8genes in white and colored potato skins and flesh. XDS, LTS, and HMS represent the potato skins of “Xindaping”, “Lingtianhongmei”, and “Heimeiren”, respectively. XDF, LTF, and HMF represent the potato fleshes of “Xindaping”, “Lingtianhongmei”, and “Heimeiren”, respectively.Data are means (±SEs) from three independent biological replicates. Different letters above the bars denote significant difference at< 0.05.

对8个在Y、R和P薯肉中的表达进行了qPCR分析。数据为3个独立生物重复的平均值(±SE)。条形图上方的不同字母表示< 0.05时的显著差异。缩写同图2。

The relative expression pattern of 8genes in Y, R, and P flesh. Data are means (±SEs) from three independent biological replicates.Different letters above the bars denote significant difference at< 0.05. Abbreviations are the same as given in Fig. 2.

已有研究表明, AtPAL基因家族在拟南芥生长发育中起着至关重要的作用。AtPAL1/2/4与木质素的生物合成密切相关[36,53], 而木质素是细胞次生壁主要成分, 对维持植物茎直立及传导水、矿物质和光合产物具有重要的作用[54]。Huang等[14]研究发现, 在、、三突变体和、、、四突变体中没有发现花粉粒, 且这些突变体都是不育的, 这与之前报道的反义抑制矮牵牛花药中黄酮类合成引起的雄性不育[55]类似。本研究中在雄蕊中特异表达, 它很可能参与了马铃薯花粉的发育。本研究还发现,在愈伤组织中特异表达,在匍匐茎中特异表达, 3个()在匍匐茎和块茎中特异表达, 而在匍匐茎、块茎、花瓣和愈伤组织中均特异表达, 它们很可能在马铃薯次生代谢和生长发育中起不同作用。

PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶, 其催化L-苯丙氨酸(L-Phe)脱氨生成的反式肉桂酸, 是许多次级代谢产物的直接或间接前体[56], 在植物响应非生物胁迫中也发挥着重要的作用[57-59]。对大多数植物而言, 体内次生代谢产物的合成和积累是植物相关基因在环境条件诱导下共同作用的结果[60]。次生代谢产物是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果, 在提高植物自身保护和生存竞争能力、协调与环境的关系上发挥着重要功能, 其合成和变化比初生代谢产物与环境间有更强的相关性和对应性[61-65]。郭伟等[66]研究发现, 盐碱混合胁迫下, 小麦叶片PAL活性的强弱与根系活跃吸收面积呈线性正相关。Chen等[67]发现, 香蕉果实在贮藏前的热处理增强了PAL活性, 减轻了冷藏冷害。王改利等[10]发现, 随土壤相对含水量的降低, 酸枣叶片中PAL活性呈现逐渐增加的趋势。Huang等[14]发现, 拟南芥中双突变体的耐旱性强于野生型。本研究发现, 7个(除)在盐胁迫(150 mmol L–1NaCl, 24 h)、甘露醇处理 (260 µmol L–1, 24 h)下的表达量较CK均有所下降, 其中在甘露醇(260 µmol L–1, 24 h)处理下下调表达; 在热胁迫(35℃, 24 h)处理下,和上调表达, 它们很可能参与了马铃薯对非生物胁迫的响应。

是花青素苷生物合成中重要结构基因[68]。Gómez-Martínez等[69]在杏()中研究发现,的表达与果实着色密切相关。李云萍等[70]在对紫心甘薯((L.) Lam.)中发现, PAL活性与紫心甘薯花青素的合成密切相关, 花青素的含量随PAL活性的升高而增加。本研究中发现,在彩色马铃薯组织中均差异表达, 其中5个基因()在彩色薯肉中上调表达, 2个基因 ()在彩色薯皮中下调表达。有趣的是, 在薯肉中差异表达的5个, 除在HMS里差异上调, 其余在薯皮中均未差异表达; 而在薯皮中差异表达的2个, 在薯肉中不表达 (FPKM=0)或低表达 (FPKM<1), 说明S在马铃薯块茎(薯皮和薯肉)花色素苷生物合成中可能发挥着不同的作用。本研究利用qPCR技术, 进一步分析了8个在遗传背景差异较小的3个不同颜色杂交子代薯肉中的表达水平, 筛选出了5个很可能参与马铃薯块茎薯肉中花色素苷的生物合成()。

此外, 本研究发现基因家族成员在上游启动子区域中存在与光、植物激素、逆境胁迫、调控生长发育以及和转录因子(MYB、MYC、WRKY等)结合的顺式作用元件。尽管PALs都催化苯丙烷类代谢途径的起始反应, 但它们是否受到不同的外界信号刺激诱导表达, 从而维持马铃薯中次生代谢产物的均衡, 有待我们进一步深入研究。

4 结论

本研究在马铃薯全基因组水平下共鉴定了8个StPAL基因家族成员, 对其进行生物信息学分析, 发现基因成员的启动子区域内含有光响应、逆境胁迫响应、激素响应、生长发育相关和转录因子调控的多种顺式元件。在愈伤组织中特异表达,在匍匐茎中特异表达,在块茎和匍匐茎中特异表达,在雄蕊中特异表达;在甘露醇处理下差异表达下调,和在热胁迫中上调表达。本研究还对3个不同颜色马铃薯块茎组织(皮和肉)进行RNA-seq测序, 分析了的表达模式, 并选用遗传背景差异较小的3个不同颜色块茎杂交子代的薯肉为材料, 进行qPCR分析, 筛选出可能参与马铃薯薯肉花色素苷生物合成的候选()基因。该研究为深入了解StPAL基因家族的特征, 进一步探究其生物功能提供了重要的参考和线索。

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Genome-wide identification of potato (L.) PAL gene family and its expression analysis in abiotic stress and tuber anthocyanin synthesis

ZHU Jin-Yong1, LIU Zhen1, ZENG Yu-Ting2, LI Zhi-Tao1, CHEN Li-Min1, LI Hong-Yang1, SHI Tian-Bin1, ZHANG Jun-Lian3, BAI Jiang-Ping1, and LIU Yu-Hui1,*

1College of Agronomy, Gansu Agricultural University /State Key Laboratory of Aridland Crop Science (Gansu Agricultural University) / Gansu Provincial Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Vegetable Sciences, Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850032, Tibet, China;3College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the rate limiting enzyme and key enzyme in phenylpropane metabolism pathway, which plays an important role in plant growth. In this study, a total of 8 gene family members (StPALs) in potato (L.) were identifiedby BlastP and Hmmer 3.1 software, and their bioinformation were analyzed by the ExPASy, CELLO, PlantCARE, and other online tool. We analyzed the relative expression pattern ofgenes in different tissues of double monoploid (DM) potato, as well as under abiotic stresses by RNA-seq in Potato Genome Sequencing Consortium (PGSC) database. We performed RNA-seq on white, red, and purple tuber skin and flesh of three potato cultivars, and the relative expression levels ofgenes in different colors tubers (flesh) of three hybrid progeny potatoes were detected by qPCR.geneswere distributed on chromosomes 3, 5, 9, and 10, and eight StPALs were closely related to tobacco () PAL. The-acting elements revealed that the promoter regions ofgenes contained many elements, including light response, stress response to adversity, hormone response, growth and development, and transcription factor binding elements. The results showed thatwas specifically expressed in stolons, andwere mainly expressed in tubers and stolons.The relative expression level ofgene were down-regulated under mannitol treatment, and the relative expression levels ofandgenes were up-regulated under heat stress. The above results suggested thatmight be involved in the tuber growth and abiotic stress response. By transcriptomic and qPCR analysis, the relative expression levels of 5genes () were up-regulated in the flesh of color potato, suggesting that they may participate in the biosynthesis of anthocyanins in flesh. These results provide a theoretical basis for further understanding the StPAL gene family and analyzing the function of StPALs in potato.

potato; PAL genes family; abiotic stress; anthocyanin biosynthesis; expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2023.24247

本研究由国家自然科学基金项目(31860398), 甘肃省科技计划资助项目(22JR5RA834), 财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系资助项目(CARS-09-P14), 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室(甘肃农业大学)开放基金项目(GSCS-2021-Z02), 甘肃农业大学“伏羲人才”计划项目(Gaufx-02Y04)和甘肃农业大学公招博士科研启动基金项目(GAU-KYQD-2020-11)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31860398), the Science and Technology Program of Gansu Province (22JR5RA834), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-09-P14), the State Key Laboratory of Aridland Crop Science of China (GSCS-2021-Z02), the Fuxi Talent Project of Gansu Agricultural University (Gaufx-02Y04), and the Scientific Research Startup Funds for Openly-recruited Doctors Agricultural University (GAU-KYQD-2020-11).

刘玉汇, E-mail: lyhui@gsau.edu.cn

E-mail: 1259245907@qq.com

2022-11-05;

2023-04-17;

2023-05-11.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230510.1732.002.html

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