棉花PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析

王梓钰，古丽斯坦·赛米，刘隋赟昊，黄耿青，张经博，郭彦君

（新疆师范大学 生命科学学院/新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

苯丙烷类物质代谢是研究最广泛的代谢途径之一，苯丙烷代谢物的生物合成和多样性是通过一系列酶实现的[1-2]。苯丙烷代谢的前3个步骤是苯丙烷代谢的公共途径，为下游代谢物提供前体，苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸4-羟化酶、4-香豆酸辅连接酶一系列的酶催化后，最终生成4-香豆酸辅酶A，然后通过不同酶的催化作用进入下游合成途径，即木质素途径和类黄酮途径，产生木质素、花青素、原花青素、黄酮类化合物、芦丁等次级代谢产物[3-4]。

PAL作为苯丙烷类代谢途径的起始酶，于1973年开始被研究[5]，现已从一些藻类、裸子植物、被子植物中分离得到了PAL基因[6-8]，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有4个[9]，杨树（Populus trichocarpa）中有5个[10]，苜蓿（Medicago sativa） 中有7个[11]，西瓜（Citrullus lanatus） 中有12个[12]，马铃薯（Solanum tuberosum）中有14个[13]。PAL是连接初级代谢和次级代谢的“代谢枢纽”，它不仅在植物的正常生长发育中发挥重要作用，也是植物应答生物或非生物胁迫时的一种关键酶[14]。 罗勒草（Ocimum basilicum）中，ObPAL基因的表达量随着干旱程度的加剧而逐步升高[15]。在冷胁迫下，芒草（Miscanthus sinensis）的耐冷株系中PAL活性显著提高，这可能是因为耐冷株系对冷胁迫做出的应答[16]。当植物受到生物或非生物胁迫时，PAL活性常常与多酚、花青素、类黄酮等次生代谢物质的积累呈显著正相关，烟草（Nicotiana tabacum）中PAL酶活性的增强可以提高木质素的含量，帮助植物抵御干旱胁迫[17]。玉米（Zea mays）苯丙氨酸解氨酶可能通过正向调节水杨酸的积累来抵抗甘蔗花叶病毒感染[18]，水稻过表达OsPAL8，促进水杨酸和木质素的生物合成和积累，显著提高水稻对褐飞虱的抗性[19]；可见，PAL可以通过调节次级代谢产物的合成来增强植物的抗逆水平。

在一个物种中，PAL基因家族常常包含多个成员，表达分析显示，PAL基因的表达常常具有时空特异性和组织特异性；当面临不同胁迫时，不同PAL基因的表达量变化也往往不同[13]。因此，PAL基因可能具有不同的分工，想要利用PAL基因进行植物抗逆性改良，需要从多个角度对各个PAL基因进行分析研究。

棉花是当今全球主要的经济作物之一，作为我国主要经济作物和主要天然纤维来源，已成为我国除粮食以外不可缺少的战略储备物资[20]，但自然降水量不足、部分地区土壤盐碱化严重、极端高温天气和“倒春寒”现象限制棉花产量和质量[21]。因此，解析棉花抗逆分子机制，将有助于我们通过遗传育种的方式，培育高产抗逆的棉花新品种。

本研究对陆地棉、海岛棉、草棉、雷蒙德氏棉中的 PAL基因进行了鉴定，分析了它们在不同棉种中的系统发育关系；对陆地棉PAL基因启动子区的顺式作用元件进行了分析，初步预测棉花中PAL可能参与的生物学过程；对陆地棉PAL基因的组织表达模式、在非生物或生物胁迫下的表达模式进行了分析，初步筛选出了一些可能参与棉花逆境胁迫应答的PAL基因，旨在了解PAL基因在棉花抗逆分子机制中的作用，为棉花遗传育种提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 棉花 PAL 家族成员的鉴定

为了鉴定棉花中的PAL基因家族成员，首先从pfam3.0（http://pfam.xfam.org/）数据库中下载PAL蛋白结构域的隐马尔可夫模型（PF00221），并从棉花基因组数据库（https://yanglab.hzau.edu.cn/CottonMD）下载陆地棉、海岛棉、草棉和雷蒙德氏棉的基因组序列和蛋白质序列，所用版本依次为TM1_WHU、H7124_ZJU、A1_WHU、D5_HAU。而后利用HMMER 3.0软件以PAL蛋白结构域的隐马尔可夫模型为模板，搜索鉴定棉花中的PAL基因家族成员。利用TBtools软件对棉花PAL蛋白质的分子质量、等电点和氨基酸数量等基本理化性质进行分析。使用WoLF PSORT（http://wolfpsort.seq.cbrc.jp）对棉花PAL蛋白的亚细胞定位情况进行预测。

1.2 棉花PAL基因家族系统进化分析

从phytozome数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和可可（Theobroma cacao）的PAL家族蛋白序列。利用MUSCLE对PAL蛋白序列进行多序列比对，使用最大似然法将比对结果输入MEGA-x软件构建系统进化树，自展值（bootstrap value）设为1 000。使用Evolview（https://evolgenius.info//evolview-v2/#login）对进化树进行美化。

1.3 棉花PAL染色体定位和共线性分析

从陆地棉、草棉和雷蒙德氏棉的基因组注释文件中提取PAL基因成员的位置信息，利用Circos软件绘制PAL基因在染色体上的位置。使用MCScanX软件分析陆地棉PAL基因家族成员与草棉和雷蒙德氏棉PAL基因家族成员之间的共线性关系，而后利用Circos软件对共线性分析结果进行可视化。

1.4 棉花PAL基因的结构和保守基序分析

将棉花PAL蛋白序列提交到MEME Suite 5.1.0在线软件预测棉花PAL蛋白的保守基序，基序数量设定为20。从棉花数据库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载基因组文件注释文件，而后将基因组注释文件输入Tbtools软件获取PAL的基因结构信息。

1.5 棉花PAL 基因启动子顺式作用元件预测及分析

提取棉花PAL基因起始密码子上游2 000 bp的序列作为启动子序列，将获取的序列提交到PlantCARE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）数据库，进行顺式作用元件分析。对获得的顺式作用元件进行整理，将整理后的顺式作用元件信息输入Tbtools软件进行可视化。

1.6 棉花PAL基因家族的表达模式分析

从棉花数据库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载陆地棉各个组织、胚珠不同发育时期和纤维不同发育时期的转录组数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），将转录组数据进行标准化处理，用log2（TPM+1）代表每个基因的表达量，使用TBtools软件绘制热图。从棉花数据库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载陆地棉在干旱、高盐、高温和低温胁迫下的转录组数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），将转录组数据进行标准化处理，同时以处理组/对照组作为每个基因的相对表达量，而后利用TBtools软件绘制热图。大丽轮枝菌处理棉花的转录组数据来源于NCBI SRA数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA745369），使用hisat 2软件将转录组数据的reads比对到陆地棉基因组，利用stringtie软件对转录本进行拼接，而后使用htseq软件对转录本进行表达定量，从中提取棉花PAL基因的表达数据，并利用TBtools对表达数据进行可视化。

1.7 RNA提取及基因表达定量分析

对陆地棉新陆早64号3周龄的幼苗进行处理，以霍格兰培养液水培组作为对照组，以NaHCO3水培组作为处理组。分别在处理0、1、3、6、12、24 h时，收集对照组和处理组的棉花叶片，利用植物RNA提取试剂盒（成都，福际生物）提取棉花叶片的RNA，而后用反转录试剂盒（成都，福际生物）将 RNA 反转录为 cDNA。使用PAL基因的特异性引物（表1），利用双链嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）进行qPCR试验，以GhHIS3作为内参基因，取3次生物学重复的平均值，采用2-ΔΔCt法计算基因的表达量，并以处理组/对照组作为每个基因的相对表达量。

表1 棉花PAL基因qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR of cotton PAL genes

2 结果与分析

2.1 棉花PAL基因家族的鉴定及序列分析

利用HMMER软件搜索棉花基因组中的PAL基因家族成员，在陆地棉、海岛棉、草棉、雷蒙德氏棉基因组中分别鉴定到15个GhPAL基因、13个GbPAL基因、7个GhePAL基因、8个GrPAL基因，根据它们在染色体上的位置进行命名（表2）。

表2 棉花PAL基因家族成员的基本信息Tab.2 The basic information of PAL family genes in cotton

理化性质分析显示，棉花PAL蛋白的氨基酸数目为206～988个，蛋白分子质量为23 432.17～109 057.41 u，理论等电点为5.85～9.09。亚细胞定位预测分析显示，大部分PAL蛋白定位在叶绿体，少数定位在细胞质和质膜（表2）。

使用在线网站MEME分析棉花PAL的蛋白保守基序，将预测到的20种基序命名为Motif 1～Motif 20。结果显示，绝大多数 PAL蛋白基序组成较为相似，只有GhPAL10、GhPAL11、GbPAL10与其他PAL成员相比，缺少一些共有基序。PAL基因的结构分析结果显示，PAL基因的外显子数目为2～6个，同一分支的基因呈现相似的基因结构（图1）。

图1 棉花PAL基因家族的蛋白保守基序和基因结构分析Fig.1 Conserved motifs and gene structures analysis of PAL gene family in cotton

2.2 棉花PAL基因家族的系统进化分析

利用棉花、拟南芥、可可、水稻、玉米、二穗短柄草的PAL蛋白序列构建系统进化树，结果显示，PAL基因家族可以分为7个亚组。单子叶植物和双子叶植物的PAL呈现出聚类分布的特征，即group1～group3中只有单子叶植物PAL家族成员的分布，而group4～group7中只有双子叶植物PAL家族成员的分布。棉花PAL家族成员分布在group4、group6和group7亚组中，而group4只有棉花PAL家族成员的分布，说明棉花PAL家族在进化过程中产生了新的分化。此外还发现，group5中只有拟南芥PAL家族成员的分布，而group6和group7中除了有棉花PAL家族成员之外，还包含了可可PAL家族成员，说明棉花和可可PAL的亲缘关系较近（图2）。

图2 棉花PAL基因家族的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PAL gene family in cotton

2.3 棉花PAL基因家族的共线性分析

为进一步探索棉花PAL基因家族的进化关系，对陆地棉、草棉、雷蒙德氏棉PAL基因进行共线性分析，结果如图3所示。

图3 棉花PAL基因家族的共线性分析Fig.3 Collinearity analysis of PAL gene family in cotton

图3结果表明，陆地棉A基因组的6个PAL基因与草棉6个PAL基因存在共线性关系，陆地棉D基因组的6个PAL基因与雷蒙德氏棉的6个PAL基因存在共线性关系。说明陆地棉PAL基因在进化时具有很大的保守性。另外，陆地棉GhPAL3、GhPAL10和GhPAL11与草棉或雷蒙德氏棉的PAL基因不存在共线性关系，说明它们是陆地棉形成后进化而来的基因。草棉GhePAL3与陆地棉PAL基因不存在共线性关系，雷蒙德氏棉GrPAL3、GrPAL8与陆地棉PAL基因不存在共线性关系，说明陆地棉PAL基因的进化过程中可能发生了基因丢失。

2.4 陆地棉 PAL基因启动子上的顺式作用元件分析

由于陆地棉是目前种植范围最广的棉花，因此，后续重点对陆地棉PAL基因进行了研究。首先，对15个陆地棉PAL基因启动子上的顺式作用元件进行了分析，共鉴定出22种元件，其中激素响应元件8种，分别为脱落酸响应元件ABRE，赤霉素响应元件GARE-motif、TATC-box，水杨酸响应元件TCA-element，茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif 和生长素响应元件TCA-box、TCA-element；胁迫相关的元件3种，包括低温响应元件LTR，干旱响应元件MBS，防御应激元件TC-rich repeats；生长发育相关的元件6种，包括类黄酮生物合成元件MBSI，光响应元件chs-CMA1a、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif、G-box；除GhPAL3外，所有成员都含有光响应元件，GhPAL1和GhPAL11中的光响应元件数量最多（图4）。基于进化树的聚类分析显示，一些亲缘关系较近的GhPAL基因启动子上顺式作用元件的种类和位置具有一定的相似性，例如，GhPAL5和GhPAL13、GhPAL2和GhPAL9、GhPAL6和GhPAL14（图4）。

图4 陆地棉PAL基因启动子上的顺式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements on PAL gene promoters in Gossypium hirsutum

2.5 陆地棉PAL基因的组织表达模式分析

为探究陆地棉PAL基因在棉花生长发育过程中的生物学功能，利用已发表的陆地棉转录组数据分析了15个PAL基因在根、叶片、花萼、茎、花托、花药、苞片、花丝、花瓣、雌蕊和不同发育时期的胚珠、棉纤维中的表达水平，其中棉花胚珠和纤维的发育时期用开花后天数（Days post anthesis，DPA）来描述，结果如图5所示，很多位于同一进化枝的GhPAL基因具有相似的表达模式，例如，GhPAL2和GhPAL9、GhPAL6和GhPAL14、GhPAL4和GhPAL12、GhPAL1和GhPAL8，在以上所提到的组织中表达模式相似，说明这些基因对中的2个基因可能发挥类似的功能。有意思的是，位于同一进化枝的GhPAL13和GhPAL15在胚珠和纤维中的表达模式相似，在根、叶片、花萼、茎、花托、花药、苞片、花丝、花瓣、雌蕊中的表达模式有差异，说明它们可能在胚珠和纤维发育过程中功能相似，而在根、叶片等组织中的功能有差异。

图5 陆地棉PAL基因的组织表达分析Fig.5 Tissue expression analysis of PAL genes in Gossypium hirsutum

从表达量的角度看，GhPAL6和GhPAL14在根、茎、花丝和开花后15 d（15DPA）的胚珠中特异高表达，说明这2个基因可能在根、茎、花丝和15DPA胚珠的发育过程中发挥较大的作用。GhPAL1和GhPAL8在开花后10 d（10DPA）和15 d（15DPA）的胚珠中特异性高表达，说明它们可能在10DPA和15DPA的胚珠中发挥较大功能。此外，不同发育时期的胚珠中GhPAL的表达水平差异较大，开花前3 d（-3DPA）、开花当天（0DPA）、开花后1 d（1DPA）、3 d（3DPA）、5 d（5DPA）的胚珠中所有GhPAL均不表达，直到开花后10 d胚珠中才有GhPAL表达。

在棉纤维中，大部分PAL基因的表达量在纤维发育的各个时期均呈现较低的表达水平或者几乎不表达，只有GhPAL1基因和GhPAL8基因在10 DPA和15 DPA纤维中表达量较高，这说明可能只有GhPAL1/GhPAL8参与了棉花纤维的发育过程。此外，注意到有3个基因GhPAL3、GhPAL10和GhPAL11在所分析的所有组织中表达量都很低。

2.6 陆地棉PAL基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

为了进一步了解PAL基因是否参与了棉花对非生物胁迫的应答过程，利用转录组数据分析了PAL基因家族成员在PEG处理、NaCl处理、4 ℃处理、37 ℃处理所造成的4种非生物胁迫下的表达模式，并利用qPCR技术分析了PAL基因在NaHCO3处理模拟碱胁迫时的表达模式。图6-A结果显示，GhPAL4在PEG处理1 h发生显著上调，GhPAL5、GhPAL12在PEG处理6 h发生显著上调，还有多个PAL基因在PEG处理12 h发生上调，说明一些PAL基因参与了棉花对渗透胁迫的应答过程。聚类分析显示，位于同一进化枝的GhPAL基因在对PEG处理的响应方面具有一定的相似性，例如，GhPAL13和GhPAL15、GhPAL2和GhPAL9、Gh-PAL6和GhPAL14、GhPAL1和GhPAL8在受到PEG处理后具有相似的表达模式，在相同处理时间后发生表达量的上调。但也有一个例外，GhPAL4和GhPAL12位于同一进化枝，受PEG诱导最为显著，但GhPAL4是在PEG处理1 h表达量显著上调随后下降，而GhPAL12在PEG处理6 h时表达量显著上调，说明GhPAL4和GhPAL12基因可能在应答渗透胁迫过程中发挥较大的作用，但二者发挥作用的时间不同，可能存在功能差异，通过协作来应答渗透胁迫。图6-B结果显示，GhPAL1、GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL6、GhPAL8、GhPAL9、GhPAL12、GhPAL13、GhPAL14、GhPAL15的表达量在NaCl处理不同时段发生上调，表明部分PAL基因与棉花应答盐胁迫过程相关。其中，GhPAL4和GhPAL12受诱导程度最高，GhPAL4在NaCl处理1 h时表达量显著上调，GhPAL12在NaCl处理6 h时表达量显著上调，且能在NaCl处理12 h时继续上调，说明二者可能在应答盐胁迫过程中发挥较大功能。

图6 PEG处理（A）、NaCl处理（B）、4 ℃低温处理（C）和37 ℃高温处理（D）后陆地棉PAL基因的表达分析Fig.6 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum after PEG treatment（A），NaCl treatment（B），low temperature treatment at 4 °C（C）， and high temperature treatment at 37 °C（D）

图6-C结果显示，GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL7、GhPAL15的表达量在4 ℃低温处理后的不同时段发生上调，说明部分PAL基因的表达受低温胁迫的诱导，其中GhPAL7受诱导程度最高。图6-D结果显示，GhPAL4、GhPAL5、GhPAL7、GhPAL12的表达量在37 ℃高温处理后的不同时段发生上调，表明部分PAL基因的表达受高温胁迫的诱导，其中，GhPAL7受诱导程度最高。说明GhPAL7既可以应答低温胁迫，又可以应答高温胁迫，此外，GhPAL7在4 ℃低温或37 ℃高温处理1 h时表达量即显著升高，说明其应答较为迅速。在37 ℃高温处理时，除了GhPAL7以外，GhPAL4和GhPAL12的表达上调程度也较高。与PEG处理和NaCl处理相似的是，GhPAL4和GhPAL12也是在处理的不同时间表达上调，即GhPAL4在37 ℃处理1 h、GhPAL12在37 ℃处理6 h时表达上调。

利用qPCR技术分析GhPAL在NaHCO3处理模拟碱胁迫时的表达模式，将qPCR结果用热图展示，基于进化关系进行聚类，结果如图7所示，15个GhPAL基因均能够对NaHCO3处理作出响应，在处理后的不同时间发生表达上调，表明PAL基因参与了棉花对碱胁迫的应答。其中，GhPAL6和GhPAL15上调程度高于其他基因，说明二者在应答碱胁迫时可能发挥较大的功能。聚类分析结果显示，同一进化枝上的GhPAL应答碱胁迫时并没有表达模式上的相似性。

图7 碱胁迫下陆地棉PAL基因的表达分析Fig.7 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum under alkali stress

2.7 陆地棉PAL基因在生物胁迫下的表达分析

为了研究PAL基因能否对大丽轮枝菌的侵染作出响应，利用大丽轮枝菌处理棉花的转录组数据[22]，对PAL基因的表达模式进行了分析，结果如图8所示，GhPAL1、GhPAL5、GhPAL12、GhPAL13的表达量在处理72、120 h发生显著上调，且在大丽轮枝菌耐受性棉花品种中棉2和敏感性品种新陆早36中均可发生显著上调，说明这些PAL基因可能参与棉花对黄萎病的抵御过程。GhPAL3、GhPAL4、GhPAL8、GhPAL12、GhPAL14和Gh-PAL15的表达水平在大丽轮枝菌处理条件下未发生明显的改变。位于同一进化枝的A亚基因组和D亚基因组的GhPAL同源基因在受到大丽轮枝菌侵染后的表达量差异较大，例如，GhPAL1在处理72、120 h时表达上调，而GhPAL8的表达量虽然较高，但在处理前后并无显著变化，说明PAL基因在应答大丽轮枝菌侵染方面可能存在功能分化。

图8 受到大丽轮枝菌侵染后陆地棉PAL基因的表达分析Fig.8 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum after infection by Verticillium dahliae

3 结论与讨论

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷途径中的一种关键酶，该家族基因已有部分成员的功能在拟南芥[9]、玉米[18]、水稻[23]等植物中被挖掘，但棉花PAL的研究仍然较少。近年来，棉花基因组数据的不断更新使得我们可以更加准确地对棉花各类基因家族进行鉴定，棉花的进化起源问题也得到进一步解析。陆地棉是由A亚基因组和D亚基因组构成的异源四倍体，草棉和亚洲棉是由A亚基因组构成的二倍体。研究发现，陆地棉、草棉和亚洲棉的A亚基因组At、A1和A2均起源于一个已经消失的基因组A0，而从进化关系上看，草棉的A1基因组比亚洲棉的A2基因组更接近于祖先A0基因组[24]，因此，这里选择草棉的基因组用于分析。本研究利用生物信息学方法，从陆地棉、海岛棉、草棉和雷蒙德氏棉中分别筛选到了15、13、7、8个PAL基因，其中从陆地棉中筛选出的PAL基因比李雨哲等[25]报道的多3个，这可能是由于本研究所使用的基因组数据更加完善的结果。这4种棉花中PAL基因数目不同，陆地棉和海岛棉的PAL基因数目约是草棉和雷蒙德氏棉的2倍，其原因一方面是由于草棉和雷蒙德氏棉为二倍体，陆地棉和海岛棉是由A、D亚基因组形成的四倍体；另一方面是由于这4种棉花在进化过程中可能发生基因的扩张或丢失。这43个棉花PAL基因的蛋白保守基序十分相似，基因结构中外显子数目大多为2个，这与许多植物（如马铃薯[13]、葡萄[26]、小麦[27]）中PAL基因家族分析的结果一致。系统进化分析显示，棉花PAL与可可的亲缘关系较近。

顺式作用元件在PAL基因发挥功能的过程中起重要作用，例如，拟南芥MYB15可以结合PAL1启动子上的AC元件，促进G-木质素的合成，增强拟南芥的基础免疫能力[28]。水稻中，OsMYB30可以通过结合OsPAL6和OsPAL8启动子上的AC-rich元件，提高OsPAL6和OsPAL8的表达量，增强水稻对褐飞虱的抗性[19]。这里，许多陆地棉PAL基因的启动子上存在重要的激素响应元件和胁迫应答元件。茉莉酸甲酯响应元件TGACG-Motif、CGTCA-Motif在陆地棉PAL基因的启动子上广泛分布，占顺式作用元件总数的28%；此外，数目较多的元件有水杨酸响应元件TCA-element（占比为8%）和干旱响应元件MBS（占比为6%）。陆地棉PAL启动子上如此之多的激素响应元件和胁迫应答元件说明这些基因可能在激素信号转导和逆境胁迫中发挥作用。另外，单个PAL基因的启动子上不只含有1种激素或胁迫响应元件，例如，在各组织中表达量较高的GhPAL14启动子上既含有水杨酸响应元件，又含有茉莉酸甲酯响应元件，说明一个PAL基因可能参与多种应答过程。结合逆境胁迫下的表达分析结果，发现PAL基因启动子上的顺式作用元件与相应胁迫具有一定的相关性。例如，GhPAL2、GhPAL4、GhPAL6、GhPAL7、GhPAL8、GhPAL9的启动子上含有干旱响应元件MBS，它们在PEG处理模拟干旱胁迫后的不同时间均发生了表达量上调；GhPAL5和GhPAL15的启动子上含有低温应答元件LTR，二者在4 ℃低温胁迫时表达量明显上调。

PAL基因家族在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用[4]。在烟草中抑制PAL基因的表达，改变了花的形态和颜色，并导致花粉活力降低[29]。突变AtPAL1和AtPAL2使拟南芥的花粉活力降低，从而导致拟南芥的育性下降[30]。棉花中，多个PAL基因在花药、花瓣和花丝中优势表达，暗示棉花PAL基因可能与烟草、拟南芥的PAL基因具有相似的功能。三尖杉（Cephalotaxus fortunei）的PAL基因主要在根和茎叶中高表达，棉花中共有9个PAL基因在根和茎中高量表达，表明PAL基因参与了植物的根和茎的发育过程[31]。棉花的PAL基因还在开花后10、15 d胚珠中优势表达，说明它们也参与胚珠的发育过程。此外本研究还发现，在同一种棉花组织中常常存在多个优势表达的陆地棉PAL基因，说明PAL基因在这些组织的发育过程中可能存在功能冗余现象。

在拟南芥中过表达暗紫贝母FuPAL1和大豆GmPAL1.1增强对干旱胁迫的耐受性[32-33]，马铃薯在38 ℃处理条件下StPAL8和StPAL12显著上调[13]。本研究发现，在PEG及NaCl处理条件下，GhPAL4和GhPAL12的表达显著上调，预测这2个基因可能正调控棉花抗旱；37 ℃处理条件下，GhPAL7、GhPAL4和GhPAL12显著上调，说明它们可能参与棉花对高温胁迫的应答过程。进一步的NaHCO3盐碱胁迫模拟发现，所有GhPAL基因的表达均在NaHCO3处理条件下发生上调，这也进一步证实了PAL基因参与植物对盐和碱胁迫的应答过程。而PAL基因对生物胁迫的应答，发现GhPAL1/GhPAL5/GhPAL12/GhPAL13的表达量在大丽轮枝菌侵染后发生上调。ZHAN等[34]和CASS等[35]研究发现，PAL基因参与了植物对生物胁迫的应答过程，不同在于抑制小麦TaPAL32和TaPAL42的表达降低了其抗条锈病；而敲降二穗短柄草BdPAL基因可提高对镰刀真菌的敏感性。这与本研究结果一致。

本研究利用生物信息学方法从4个棉种中鉴定出了43个PAL基因家族成员，其中，陆地棉含有15个。通过分析陆地棉PAL家族基因的启动子顺式作用元件和诱导表达模式发现，陆地棉大多数PAL基因均具有胁迫响应相关元件，并且一些GhPAL可在不同程度上受渗透胁迫、盐胁迫、碱胁迫、低温、高温等非生物胁迫的诱导，且受大丽轮枝菌生物胁迫的诱导。其中，GhPAL4和GhPAL12这对同源基因，其启动子上含有胁迫响应元件，且在渗透胁迫、盐胁迫、高温胁迫时表现出较高的表达量，但其响应时间不同，因此，推测这2个基因可能通过部分功能分化协同应答多种非生物胁迫。GhPAL1、GhPAL5和GhPAL13的表达在大丽轮枝菌处理条件下发生显著上调，推测它们可能参与棉花对黄萎病的抵御过程。这些基因为进一步解析PAL基因家族响应胁迫的潜在功能提供了参考，但后续仍需要试验证据对这些PAL的功能进行解析。