基因修饰小鼠实验室生物安全管理体系建设

王芊芊， 刘 冲， 傅 军， 陈若宁， 刘迪文， 汪 洌，

（浙江大学a.实验动物中心；b.医学院，杭州 310058）

0 引言

自2021 年4 月15 日，《中华人民共和国生物安全法》正式施行［1］，预示着生物安全自此由规范约束上升到法律约束的高度。生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力［2］。实验室生物安全是指以实验室为科研和工作场所时，实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，避免危险生物因子造成实验室人员暴露，向实验室外扩散并导致危害的综合措施［3］。

基因修饰小鼠模型在生物学、基础医学、肿瘤学、新药研发和疾病治疗等诸多领域已显示出其优势与应用前景［4-8］。基因修饰小鼠实验室的建设也方兴未艾，相比于发展基因修饰技术，实验室生物安全一直是容易被忽视的问题。近年来，多起生物类科研院所和高校实验室引发的生物安全事件已严重威胁甚至危害到公众的生命安全，因此建立健全基因修饰实验室生物安全管理系统迫在眉睫。基因修饰小鼠实验室从性质上并不属于单一结构的实验室，其涵盖分子生物学、细胞生物学、小鼠胚胎操作和基因修饰小鼠饲养繁育实验室等功能区块，属于综合性实验室，在管理上难度更大，所面临的生物安全风险相较于单一功能实验室更高。以结合基因修饰小鼠实验室，在生物安全管理体系建设中的管理组织构架、制度建设、风险评估、监督机制和人员培训等方面进行了有益探索，以期为同类型实验室生物安全管理提供一定的借鉴和参考。

1 基因修饰小鼠实验室风险评估

1.1 基因编辑技术的风险

许多人工重组DNA分子都存在着生物安全危害。例如用于重组和扩增DNA 分子的大肠杆菌可能与其他细菌的基因信息发生交换，而其中的某些细菌对人类是具有致病性的。再如，将全部或部分癌基因DNA片段连接到细菌质粒上，这种重组的DNA分子很可能更易在人类或其他物种中传播，从而增加患癌或其他疾病的风险［9-11］。此外，在操作重组微生物的工作中，还需要考虑的风险包括插入基因编码是一种已知的毒素还是相对特征不明的毒素？修饰作用是改变宿主的类别还是病毒的细胞趋向性？修饰作用能否增加病毒的复制能力？插入基因能否改变细胞周期？等［3，12］。由于科学界对基因修饰技术的担忧促使1975 年NIH对重组DNA 分子研究指南的开发。指南同时指导成立了生物安全委员会（institutional biosafety committee，IBC），对使用重组或人工合成技术的研究进行审核和监督，并对研究人员在设计基因治疗的实验给出总体框架［13-14］。在我国，使用基因编辑技术必须遵照《生物安全法》和《基因工程安全管理办法》等法律法规，并在实验开展前通过实验动物福利伦理审查。

1.2 通过基因工程技术研制基因修饰小鼠的风险

通过基因工程技术研制对特定病原体易感的基因修饰小鼠存在很大的风险。例如，利用hACE2 转基因小鼠研究新型冠状病毒（COVID-19）的感染机制、疫苗开发和治疗［15-17］。在造模以及后续的研究中稍有不慎都极有可能感染研究人员或进而危害公共安全。不涉及感染性基因修饰小鼠的实验绝不意味着就不存在生物安全的风险。基因修饰小鼠主要可分为转基因小鼠和基因敲除／敲入小鼠，分别是通过基因工程的手段将一段外源基因片段导入小鼠生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎中，使其整合进小鼠基因组中并使其表达某一遗传性状和通过同源重组原理敲除／敲入某一个或某一段特定基因片段使其丧失或获得某些遗传性状。基因敲除小鼠一般不表达特殊的生物危害，而转基因小鼠和基因敲入小鼠因引入外源的基因片段，会表达不同于野生型小鼠的外源基因的蛋白，这些蛋白是否会对人类产生威胁？基因在不同物种间的漂移会破坏野生近缘种的遗传多样性，如果基因修饰小鼠逃逸很有可能污染野生型小鼠的基因库也是很大的风险。此外还有增加人畜共患病的传播机会，甚至给人类带来灾难性的后果［12，18-19］。

因此，基因编辑技术和基因修饰小鼠研制存在着一定的生物安全风险，需制定详细地审核和监督机制。故实验室在应用基因编辑技术之前必须通过学校实验动物福利伦理审查委员会的审批（该委员会审核范围包含了生物安全相关内容），获批后方可开展相应的实验，且委员会会对全实验流程进行监督。

1.3 基因修饰小鼠运输、饲养、繁育及实验中的生物安全风险

基因修饰小鼠的进口、引种和运输以及到达动物饲养设施后的隔离检疫过程中都有可能存在感染未知病原微生物的风险。在基因修饰小鼠的运输中，要特别注意运输盒的牢固性，以免基因修饰小鼠逃逸，并制定相应的动物逃逸处理应急预案。基因修饰小鼠饲养及繁育过程中，小鼠本身的活动会产生气溶胶，饲养人员更换小鼠笼盒时，会吸入大量的气溶胶。如果基因修饰小鼠被病原微生物污染，则可能感染实验人员。动物实验活动中可能会出现特别的生物安全问题，如实验人员可能会被小鼠抓伤或咬伤［20］，或因实验中操作不当受到的伤害。因此，基因修饰小鼠实验室从动物引种、运输、饲养、繁育和研制直至实验动物人道终点都必须建立全流程、严格的管理制度。

2 基因修饰小鼠实验室生物安全管理体系的建立

实验室生物安全管理体系的建立是一个系统性工程，必须符合2008 年颁布的国标《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）。在体系的建立和维护过程中，要随时根据国家相关法律、法规和标准的变化，以及卫生行政主管部门的要求予以修订，在此基础上还可以参考WHO《实验室生物安全手册》等资料［21］。单位和实验室领导对于实验室安全管理体系建立、机构设置和职能划分以及资源配置等起着决定性作用。实验室生物安全最高管理者应确定方针和目标［22-23］。

2.1 建立相对完善的基因修饰小鼠实验室生物安全管理体系

基因修饰小鼠实验室是学校大型公共技术服务平台，由医学院和实验动物中心（以下简称“中心”）共建。生物安全管理工作分为3 个层级［24-25］。第1 级学校成立有实验室技术安全管理办公室，管理全校的实验室安全，包括实验室生物安全；第2 级是实验室所属的医学院的实验室技术安全管理办公室，由院长为第一责任人；第3 级即为实验室，由实验动物中心主任负责。中心主任在充分掌握国家相关法规和标准的要求下，负责制定实验室制度和管理实验室所有的实验活动，并明确实验室的组织构架和其他部门的关系；负责定期组织人员参加安全培训并制定监督健康计划；保障实验室所有安全设施设备的落实到位和定期检修；确保所有实验人员熟悉并掌握实验流程，了解所有可能存在的生物安全风险。中心主任指定1 名实验室技术负责人，负责提交实验计划和安全评估报告并负责实验室所有实验项目的具体实施。另外指定1 名安全负责人，负责监督实验室的一切实验活动是否存在安全风险并有权阻止一切不安全的实验行为（见图1）。

图1 基因修饰小鼠实验室生物安全管理体系构架

2.2 编制基因修饰小鼠实验室生物安全管理体系文件

按照生物安全管理体系文件的框架依次编写实验室生物安全管理手册（包含组织构架、人员职责、生物安全管理方针和目标、管理责任和个人责任等内容）、实验室程序文件（含25 个）、标准操作程序（32 份操作规程和规范）以及生物安全记录表格（共21 项）和应急预案［26-27］（见表1）。实验室生物安全管理手册由实验动物中心主任审核后实施，并根据实验室实际运行情况定期修订。

3 基因修饰小鼠实验室的设计与管理

3.1 实验室的设计

分子细胞学实验室主要功能是完成基因修饰小鼠研制的上游和下游实验，包括载体构建、载体的验证、ES细胞培养和传代、打靶ES 细胞的筛选和基因修饰小鼠的基因型鉴定等工作。实验室属于生物安全Ⅰ级实验室，设计符合BSL-1 的建设要求［28］，根据主要实验内容进行必要的分区：样本制备区、试剂配置区、清洗灭菌区、试剂存放区和PCR区。

小鼠饲养和胚胎操作实验室设置在中心的屏障系统内，使用许可证编号：SYXK（浙）2018-0016。属于动物生物安全Ⅰ级实验室，符合ABSL-1 的建设要求［28-29］。屏障区域为3 走廊设计，采用3 级空气过滤系统（初、中、高效空气过滤器），屏障内空气可达万级净化标准。所有实验小鼠均为SPF级小鼠，并采用独立通气式笼具（individual ventilated cages，IVC）饲养。饲料经Co-60 辐照，饮水采用121 ℃，1 h 高温高压的灭菌。屏障内设置监控系统，接入中心监控室，除第一更衣室、第二更衣室和风淋室外，每间实验室和走廊均为监控全覆盖。

3.2 实验室安全防护设备配置

分子细胞学实验室配有应急喷淋和洗眼设备，小鼠饲养和胚胎操作实验室的生物安全防护设备主要有生物安全柜和脉动真空压力蒸汽灭菌器。灭菌器每年由杭州市特种设备检测研究院检测并出具质检报告。每半年由中心兽医团队用3MTM压力蒸汽灭菌生物培养指示剂对实际压力蒸汽灭菌效果进行生物监测。

个人防护装备主要有防静电全身隔离衣、手套、医用外科口罩、3M口罩、面罩、护目镜和厚底工作鞋等。实验室安全员会定期检查和更换所有的防护设备和个人防护装备。

3.3 实验室消毒与卫生管理

实验室和屏障设施初效过滤器每月更换一次，中效过滤器每3 个月更换一次，高效过滤器每年定期更换一次。每天至少用消毒药水全面消毒一次分子实验室工作台面，清洁实验室地面，所用的消毒剂根据潜在微生物的类别使用75%乙醇或0.5%次氯酸钠等［22］。实验过程中如有活性物质溅出要及时清理并消毒，所有操作参照浙大实验动物中心编制的“分子细胞生物学实验室洗涤、污物处理操作规程”（LAC-SOP-009）。

实验小鼠饲养台面在操作前后均需用消毒剂擦拭，饲养间每天需用消毒水拖地，定期擦拭墙面和顶面，消毒剂需轮换使用以防长期使用同一种消毒剂导致细菌产生耐药性。所有操作参照浙大实验动物中心编制的“屏障系统的日常卫生与消毒的操作规程”（LAC-SOP-011）。新的IVC 笼架运至中心后，在特定房间内进行过氧化氢消毒后推至屏障系统内。所有饲养实验小鼠的IVC笼架和主管道每3 个月全面清洗消毒。所有操作参照浙大实验动物中心编制的“实验小鼠IVC笼架清洗消毒的操作规程”（LAC-SOP-024）。

3.4 实验室仪器和试剂的安全管理

为加强实验室仪器设备和试剂管理，实验室设置专人管理所有的仪器设备，负责试剂耗材的采购和保管。建立实验室仪器设备台账，对24 h 供电的仪器采取双路供电，且连接报警系统。分子生物学所涉及的试剂复杂多样、危害性强，很多都具有强腐蚀性、毒性和致畸性［30］。因此实验室建有试剂目录和分类表（LAC-TABLE-006），整理了各种实验试剂的理化特性、使用注意事项和存储要求等信息。设有专人负责试剂订购、分类和发放工作。对于像溴化乙啶等毒性强、有致癌性的试剂有专用存储柜。实验室所用的危险化学品均为双人双锁保管，并有购买、取用记录（LAC-TABLE-007，LAC-TABLE-008）。

3.5 实验小鼠疾病预防控制

实验小鼠的饲养和繁育要严把实验动物质量关，严防人畜共患病。措施主要包括：①中心对实验动物供应商通过问卷调查和实地考察的方式进行审核和评价，不定期对供应商的产品进行抽样检查。②对引入中心的实验小鼠有严格的质量审核、隔离检疫和生物净化等流程。参照浙大实验动物中心编制的“实验动物进出动物设施操作规程”（LAC-SOP-015）、“基因修饰小鼠隔离检疫操作规程”（LAC-SOP-016）和“基因修饰小鼠生物净化操作规程”（LAC-SOP-017）。③对屏障内日常饲养的实验小鼠定期进行微生物质量监测，参照国标“实验动物微生物学等级及监测”（GB14922.2-2011）。

4 实验人员管理与培训

4.1 实验人员资质管理

实验室实验人员管理依托于浙江大学实验动物中心。人员招聘严格按照浙江大学事业性质岗位聘用人才（劳务）派遣员工操作程序。所有实验人员均具有分子生物学、细胞生物学、医学、实验动物学、动物医学和微生物学等相关学科的专业背景，入职后经专业技术培训后方可上岗。在ABSL-1 的工作人员均通过浙江省实验动物技术人员培训并获得合格证。操作脉动真空压力蒸汽灭菌器的工作人员需取得《中华人民共和国特种设备作业人员证》，持证上岗。实验室1 名技术人员已参加由杭州市卫生健康委员会组织的2021 年杭州市病原微生物实验室生物安全培训班并已通过考试，成绩合格。

4.2 实验人员进出管理

分子细胞生物学实验室工作人员经培训授权持有门禁卡，凭本人门禁卡进出实验室。屏障区域采取封闭式管理，出入口处及屏障内每个房间均设有门禁系统，实验技术人员培训获得中心指纹权限和门禁密码，凭本人指纹和门禁密码进出屏障系统内的实验室。实验人员进出屏障系统必须严格按照浙大实验动物中心编制的“实验人员进出屏障设施操作规程”（LAC-SOP-018）进行个人防护装备的穿戴与更换。

4.3 实验人员健康管理

实验室新进人员入职前需完成入职健康体检，对于有相应疾病或对动物毛发过敏等不适宜从事实验动物饲养管理和操作的人员，中心人事部门将及时调整其工作岗位。实验室所有工作人员每年至少进行一次体检，并建立员工健康档案。

4.4 实验人员培训管理

绝大多数实验室生物安全事故发生的根本原因在于缺乏生物安全意识和疏于管理。有调查表明，很多受访大学生不了解病原微生物分类、生物安全实验室等级的分类、动物抓伤和咬伤后处理、生物安全柜的正常使用方法和生物安全防范等［31-32］。因此对从业人员的培训和教育至关重要。中心定期和不定期组织各项生物安全培训讲座，包括每年组织人员参与学校和学院举办的消防安全知识讲座和演习。通过组织实验人员参与各种培训和讲座不断强化人员的安全意识，降低生物安全风险。

5 生化固废／液和动物尸体的处理

高校中常见的生化固废／液有放射性物质、化学试剂和实验器械和耗材等［33］，基因修饰小鼠实验室涉及化学试剂种类较多，有些具有很大毒性，或具有致癌致突变性，比如溴化乙啶（EB）染料，不能直接排放。实验器械和耗材主要有注射器及针头、口罩、手套、敷料、培养皿、离心管、移液管和培养基等，可能会沾染有毒有害物质，决不能与生活垃圾混放。基因修饰小鼠实验室还涉及实验小鼠的尸体和组织材料处理。

目前中心管理模式是所有的生化固废／液全部放入指定的生化固废／液废弃物桶，用特定的生化固废垃圾袋盛装，当废弃物达到容器的3／4 时，即由相关人员封口。所有在实验中产生的碎玻璃、针头和刀片等锐器一律投入利器盒。学校的生化固废／液现已实行网络化管理模式，各实验室的生化固废／液和锐器盒由指定人员封扎并收集，在校网园实验室与设备管理处平台上提交申请，审核通过后在指定时间将生化固废／液送到校指定回收点。

实验小鼠的尸体和组织材料使用专用的生物安全袋密封包装，称重登记后送学校指定的动物尸体存放间，放入-20 ℃冰柜内，由具备专业资质的相关公司统一定期清运至校外进行无公害化处理。所有操作参照浙大实验动物中心编制的“实验动物人道终点、安乐死与尸体处理操作规程”（LAC-SOP-031）。

6 结语

高校实验室生物安全因隐蔽性强、人员密集和潜在有毒有害试剂较多等因素往往很容易被忽视，而一旦发生事故又会引起极大的危害。所以建立完善的生物安全防范体系，提前做好生物安全风险评估，制定严格的生物安全管理制度和监管机制对于高校实验室工作的开展至关重要。

基因修饰小鼠实验室始建于2015 年底，随着近7年的发展在专业技术上已取得重大突破，建成了稳定的专业技术队伍，已为本校多个科研团队提供了基因修饰小鼠研制技术服务，相关成果已发表在《自然》等国际顶级学术期刊。在浙江省实验动物管理办公室、校实验室与设备管理处、医学院、实验室技术安全管理办公室和院领导的多方指导下，基因修饰小鼠实验室生物安全体系已初步建成，在实验试剂管理、实验动物疾病预防控制和实验人员管理与培训等方面也已初见成效。通过该体系的建立和运行，有效保障了实验室的安全运转，为学校基因修饰技术服务需求保驾护航。但同时，在生物安全制度的落实和监管、实验人员安全意识、危化品管理上仍需不断完善。生物安全关系到每一个人的生命健康和家庭幸福，在建设“双一流”大学的征程上，不仅要全面提升专业技术服务水平为科研支撑做出贡献，更要以人为本，重视生物安全，加强管理，防患未然，为助力医药和生命科学等各学科发展做好有力支撑。

致谢：

感谢浙江大学动物科学学院曾卫东教授对本论文的修改。