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高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物

2023-09-13陈海燕张慧宁马春芳杨俊华谢荣国

饲料博览 2023年4期
关键词:磺胺类磺胺色谱法

陈海燕,张慧宁,马春芳,陈 娟,杨俊华,谢荣国,杨 奇

(宁夏回族自治区兽药饲料监察所,银川 750001)

目前有效的抗生素很多,但磺胺类药具有抗菌谱广、性质稳定、品种多、价格低、使用简便等优点[1],在控制急性泌尿系统感染中有重要价值。所以在畜牧养殖业中常被用作治疗动物肠道感染等疾病,若以预防为目的在饲料中长期添加,会使致病菌产生耐药性,磺胺类药物也因此会残留在动物的肌肉等组织中,影响人的身体健康[2]。磺胺类抗生素还可以通过沉降、吸附等作用蓄积在地表水沉积物中[3],造成水体污染。农业农村部第194号公告颁布后,磺胺类药物禁止作为饲料药物添加剂被使用,其检测对饲料质量安全控制十分必要。高效液相色谱检测法能够对饲料中的磺胺类药物含量进行快速检测,且检测结果准确,误差小,利于相关人员开展饲料中磺胺类药物含量测定[4]。本研究采用高效液相色谱法,对饲料中磺胺类药物进行测定,将GB/T 19542—2007[5]《饲料中磺胺类药物的测定高效液项色谱法》中称样容器锥形瓶改为离心管,提取液乙腈体积减半,验证建立更加合理、利于操作的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号为Agilent 1260 infinity Ⅱ),安捷伦科技有限公司产品;离心机(型号为CR22G),日本日立公司产品;旋涡混匀器(型号为IKA MS3),德国艾卡公司产品,分析天平(型号为AX-205)、电子天平(型号为LD202-L),梅特勒-托利多公司产品;超声清洗器(型号为KQ-400KDB),昆山舒美超声仪器有限公司产品;固相萃取装置(型号为SepLine-S4),莱伯泰科有限公司产品;振荡器(型号为WSZ-100-A),上海一恒科学仪器有限公司产品;纯水仪(型号为Milli-Q Integral 5),默克密理博公司产品。

1.2 仪器条件

色谱条件:紫外检测器,检测波长为270 nm;色谱柱,Agilent C18柱,柱长250 mm,内径4.6 mm;流动相:乙腈∶4%冰乙酸水=25%∶75%,流速1.0 mL·min-1,进样量20 μL。

1.3 检出限与定量限

该方法的定量限,磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶为5 mg·kg-1;磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉为2 mg·kg-1。

1.4 试剂

乙腈(色谱级,批号为178563)、甲醇(色谱级,批号为175614),Fisher chemical 产品;冰乙酸(优级纯,批号为180219),天津市科密欧化学试剂有限公司产品;超纯水,德国默克密理博Milli-Q Integral 5 制得;碱性氧化铝SPE 小柱(批号为029639192A),沃特世Waters Spe-Pak 1 000 mg·(12 mL)-1。

1.5 标准品

1.5.1 标准贮备液配制

标准贮备液配制过程见表1。配制好后在-16 ℃避光保存,有效期6个月。

1.5.2 混合标准中间液

表1 标准贮备液配制

表2 5种磺胺类药物的回收率及精密度

分别量取一定体积的标准贮备液置于同一25 mL棕色容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,使其成为浓度100 μg·mL-1的混合标准中间液。4 ℃避光保存,有效期1个月。

1.5.3 绘制混合标准工作曲线

准确量取混合标准中间液10、20、50、150 μL和500 μL,分别置于10 mL 的棕色容量瓶中,用流动相定容至刻度,使浓度分别0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1,绘制混合标准工作曲线。

1.6 样品制备及处理

样品制备:选具有代表性的饲料500 g,粉碎过40目筛,混匀备用。

提取:准确称取2 g(精确至0.001 g)试样于50 mL离心管中,加入25 mL乙腈,涡旋1 min,振荡30 min,9 000 r·min-1离心5 min,备用,同时做空白对照。

净化过程:碱性氧化铝SPE小柱,取10 mL乙腈淋洗,准确移去10 mL样品试液过滤,流出后吹干。分别用2 mL 流动相洗脱2 次,收集洗脱液混匀,过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.7 阳性添加样品

向称取的样品中分别加入20、40、100 μL 和300 μL浓度为100 μg·mL-1的混合标准贮备液,制成浓度为1、2、5mg·kg-1和7.5mg·kg-1的阳性添加样品,上机浓度分别为0.2、0.4、1.0 μg·mL-1和1.5 μg·mL-1,每个浓度阳性添加做6个平行,连续3次。

2 结果与分析

2.1 色谱图

5 种磺胺类药物0.2 μg·mL-1的标准图谱,1 mg·kg-1阳性添加回收及空白样品图谱见图1~3。

图1 5种磺胺类药物0.2 μg·mL-1标准图谱

图2 5种磺胺类药物1 μg·mL-1回收图谱

因饲料中粗蛋白等含量较高,基质复杂容易对目标物形成干扰,选用乙腈做流动相,可以沉淀蛋白质;流动相的pH 会影响磺胺类药物在色谱柱中的分离,水相选用4%的冰乙酸水利于不同磺胺类药物的分离。试验结果表明:5种磺胺类药物标准图谱与添加回收图谱的色谱峰保留时间一致,且峰形良好,分离度好,互不干扰,说明流动相比例合理;由添加回收图谱可以看出,样品基质对添加回收影响小,说明试验条件及方法可行。

2.2 标准曲线

以含量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,见图4~8。

图4 磺胺嘧啶的标准曲线

图6 磺胺二甲基嘧啶的标准曲线

图7 磺胺甲恶唑的标准曲线

图8 磺胺喹恶啉的标准曲线

由图4~8可以看出,5种磺胺类药物回归方程分别为:磺胺嘧啶y=87.484 9x-0.874 3,磺胺间甲氧y=72.653 2x-0.765 0,磺胺二甲基嘧啶y=75.852 7x-0.717 9,磺胺甲恶唑y=75.664 7x-0.816 4,磺胺喹恶啉y=66.821 4x-1.231 0,5 种药物5 个浓度(0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1)的线性均在0.999 9以上,线性良好。

2.3 回收率

阳性添加浓度为0.2、0.4、1.0mg·kg-1和1.5mg·kg-1四个浓度时,平均回收率为85.8%~113.0%,变异系数(RSD)为0.2%~7.6%,说明该方法精密度良好,符合方法学要求。

2.4 注意事项

磺胺类药物属于酸碱两性物质[6],标准贮备液配制过程中,磺胺喹恶啉超声后若有混浊不溶现象,可适量加0.1%氢氧化钠溶液50~100 μL,直至溶解后定容。标准品配制过程中,所用的容量瓶均建议采用棕色。

3 应 用

2022 年对宁夏区内生产企业、经营店、养殖场的猪鸡配合饲料38 批次牛、羊精料补充料44 批次、自配料38批次,共计120批次饲料样品,应用该方法进行检测,均未检出上述5 种磺胺类药物,检测结果见表3。

4 讨 论

自饲料中禁止使用抗生素公告颁布后,饲料中抗生素检测成为检验检测机构的主要任务,磺胺类药物为抗菌药品种数量最多的人工合成药物。饲料中磺胺类药物分析测定方法有多种,例如高效液相色谱法[7-9]、液相色谱-串联质谱法[10-11]、酶联免疫法、放射受体分析法等,液相色谱-串联质谱检测法成本较高,酶联免疫法易出现假阳性、假阴性反应,需用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法进行确证,放射受体分析法有时会出现交叉反应及假阳性反应,样品处理复杂,其中高校液相色谱法较成熟并被广泛应用。本研究针对《饲料中磺胺类药物的测定高效液相色谱法》中的前处理方法进行了改进,改进后的方法更加便捷、高效,更有利于进行大批量饲料样品中常见磺胺类药物的风险监测。

5 结 论

利用高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物,将GB/T 19542—2007方法中称样容器锥形瓶改为离心管,利于样品旋涡、振摇、离心等操作。提取液体积由50 mL乙腈改为25 mL,降低有机试剂的使用量,减少环境污染及对操作人员的毒性作用。改进后的方法更为简单,利于操作和样品的批量处理。经验证,改进的方法各项参数均符合方法学要求,可用于饲料中非法添加磺胺类药物的检测,对饲料禁止使用磺胺类药物的筛查具有重要意义。

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