二甲双胍通过抑制线粒体氧化磷酸化降低结直肠癌干细胞的自我更新能力

颜 畅，刘爽，宋庆志，胡艺冰

北京大学深圳医院1胃肠外科，2乳甲外科，广东 深圳518036

结直肠癌是我国发病率第2位、死亡率第4位的恶性肿瘤［1］。癌干细胞（CSCs）是结直肠癌中主导化疗耐药、转移和治疗后复发的细胞亚群［2］。针对结直肠CSCs的治疗对提高结直肠癌的预后尤为重要［3］。

目前鉴别和分选CSCs主要依赖其细胞膜表达的CD133、CD44、Lgr5等分子标志物［4］。但是，由于缺乏统一的标志物，且此类标志物的功能和机制尚并不完全清楚，靶向CSCs标志物的临床应用仍相对受限［5］。准确的来讲，CSCs区别于癌分化细胞的主要特征是其具备更强的自我更新能力、分化潜能、成瘤能力等生物学功能，而不是简单表达某种标志物［2-6］。我们前期的研究表明，结直肠CSCs除了具备更强的自我更新能力和体内成瘤能力，还具有更高的线粒体氧化磷酸化和活性氧（ROS）水平［7,8］。因此，靶向抑制结直肠CSCs线粒体代谢或ROS是潜在的治疗手段。

糖尿病和结直肠癌的发生和预后存在复杂的关系［9］。较多研究显示，糖尿病患者有更高的结直肠癌发生率和癌症特异性死亡率［10］。二甲双胍是世界上广泛应用的治疗II型糖尿病的药物。研究表明，二甲双胍能显著降低糖尿病人群中结直肠癌的发生率，并显著提升结直肠癌病人的预后［9,11］。尽管有研究显示二甲双胍可以调控肿瘤的葡萄糖及线粒体代谢，抑制结直肠癌［12,13］。其具体机制仍不清楚。二甲双胍能否通过抑制结直肠CSCs的线粒体代谢，从而促进其分化尚缺乏研究。本研究拟用二甲双胍与原代结直肠癌来源的类器官中的CSCs体内和体外共培养，观察其促进结直肠CSCs分化的作用，并进一步探讨其机制，为靶向结直肠CSCs的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 细胞和动物

已转染Wnt 报告基因慢病毒（TOP-GFP）的结直肠癌病人来源的类器官（PDOs）来源于本课题组已建立的结直肠癌PDOs活样本库，样本获取及研究已充分经过知情同意，并获得伦理委员会许可（IRB ID:20141106）［7,8］。SPF级非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID，北京华阜康公司）。所有实验程序均经伦理委员会批准，并参照《实验动物护理和使用指南》执行（IACUC ID:2014S652）。

1.2 试剂

DMEM/F12培养液、B27、MitoSOX红色荧光探针试剂盒（Invitrogen）；人表皮生长因子、胃泌素、基础成纤维细胞生长因子、二甲双胍、半乳糖、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Sigma）；Trizol 裂解液、逆转录试剂盒（Takara）；实时荧光定量PCR试剂盒（Thermo）；基质胶、FACS Aria II流式细胞仪（BD Bioscience）；四甲基罗丹明乙酯（tetramethyrhodamine,ethyl ester,TMRE）试剂盒（Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 类器官培养 收集活样本库中结直肠癌PDOs，加入0.025%胰蛋白酶溶液在37 ℃下孵育15～20 min，消化为单细胞后包埋至基质胶（去生长因子、无酚红）并接种至超低吸附培养皿。待基质胶聚合后，加入类器官基础培养基，并置入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每3 d更换一次类器官基础培养基［8］。类器官基础培养基为添加人表皮生长因子（50 ng/mL）、胃泌素（10 nmol/L）、1×B27和A83-01（500 nmol/L）的DMEM/F12培养基［8］。

1.3.2 流式细胞分选癌干细胞 收集已转染Wnt报告基因慢病毒（TOP-GFP）的结直肠癌PDOs，并制备为单细胞悬液（1×107/mL）。使用流式细胞仪根据GFP的荧光强度，分选出表达最强的5%～10%细胞为GFP+细胞（高表达Wnt，即Wnt+细胞，富集癌干细胞）和表达最弱的5%～10%细胞为GFP-细胞（不表达Wnt，即Wnt-细胞，富集癌分化细胞）［7,8］。

1.3.3 细胞球体形成实验 细胞接种在超低吸附6 孔板内（1000/孔），在干细胞培养基中加入药物（5、10、20、30 μmol/L 二甲双胍、10 mmol/L 半乳糖、5 mmol/L NAC）或等体积的干细胞培养基作为空白对照，置入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每3 d补0.5 mL干细胞培养基及药物，9 d 后观察细胞球体的形态及数量［8］。干细胞培养基为添加人表皮生长因子（10 ng/mL）、1×B27 和基础成纤维细胞生长因子（10 ng/mL）的DMEM/F12培养基［8］。

1.3.4 克隆形成实验 将细胞接种在6孔板（1000/孔），贴壁后加入10 μmol/L二甲双胍或等体积的干细胞培养基，置入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每3 d补0.5 mL干培养基及药物，9 d后去除培养基，以4%多聚甲醛常温固定30 min后，用0.1%结晶紫染色15 min，光学显微镜观测克隆的数目及大小［14］。

1.3.5 体内有限稀释实验 用基质胶包被细胞后按浓度梯度皮下注射至NOD/SCID小鼠背部（100 μL/侧），每5 d经腹腔内注射二甲双胍（100 mg/kg body weight）或对照［15］，每3 d监测肿瘤的起始及大小。待肿瘤生长至一定体积后，处死小鼠，收获肿瘤，计数成瘤率和称量肿瘤质量。根据网站ELDA:Extreme Limiting Dilution Analysis（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html）提供的分析工具计算各组细胞中可成瘤细胞频率，并计算统计学差异［16］。

1.3.6 流式细胞术检测细胞Wnt表达率和活性 接种纯化的Wnt+细胞在超低吸附6孔板内，在干细胞培养基中加入对应浓度的药物或对照，置入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。3 d后收集细胞通过流式细胞仪检测细胞的GFP表达率，并检测GFP+细胞中GFP的平均荧光强度［8］。

1.3.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）使用Trizol裂解液提取细胞总RNA，加入适量无酶无菌水调节RNA浓度至500 ng/μL；参照逆转录试剂盒（Takara）反应体系逆转录生成cDNA；采用SYGR荧光染料掺入法检测目的基因表达。每组实验重复3次，以GAPDH作为实验内参。引物序列来自于已发表文献［17］，引物由武汉擎科生物有限公司合成（表1）。本研究使用的引物如下：

表1 qRT-PCR对差异表达的mRNA的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR for differentially expressed mRNAs

1.3.8 海马能量代谢仪检测细胞氧化率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）将Wnt+细胞接种在96孔板（1×104/mL），每孔加入80 μL干细胞培养基，经10 μmol/L二甲双胍或对照处理48 h后，按照安捷伦实验操作进行后续实验并计算OCR和ECAR［18］。

1.3.9 探针检测线粒体膜电位和ROS水平 获取实验组和对照组Wnt+细胞，按照试剂盒说明每孔加入100 nmol/L TMRE探针或MitoSOX探针，37 ℃避光孵育探针30 min，离心并洗涤细胞2遍后，PBS溶液重悬，上流式细胞仪检测线粒体膜电位和ROS水平［19］。

1.3.10 NDI1转染与鉴定 根据已报道的文献引物序列［12］，从酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）中纯化NDI1 cDNA，引物如下：FWD: 5'ATAAGATCTGCCGCCA CCATGCTATCGAAGAATTTGTAT3'；REV: 5' TATG AATTCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTAA TCCTTTAAAAAAGTCTCT3'。pCMV-NDI1-Puro慢病毒质粒构建及病毒包装由上海生博生物医药科技有限公司提供。在培养基中加入10 μg/mL polybrene，慢病毒以感染复数25（MOI=25）感染结直肠癌类器官细胞72 h后，更换含有1 μg/mL Puromycin的培养基筛选稳定转染NDI1 的细胞。通过免疫印迹检测细胞中NDI1的表达情况。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 22.0和Graphpad 8.0进行统计分析。所有实验均重复3次，正态分布的定量数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍选择性抑制结直肠CSCs的自我更新

采用不同浓度二甲双胍（5、10、20、30 μmol/L）与原代结直肠癌类器官（PDO1、PDO2和PDO3）中分选出的Wnt+细胞和Wnt-细胞分别在体外共培养形成细胞球体。体外细胞球体形成实验显示不同浓度的二甲双胍均可以显著抑制Wnt+细胞自我更新形成细胞球体（P＜0.01，图1A），对Wnt-细胞无显著抑制效应（P＞0.05，图1A）。当二甲双胍浓度升至10 μmol/L后，其对Wnt+细胞形成细胞球体的抑制率已超过50%（图1A）。因此，选取10 μmol/L二甲双胍与Wnt+细胞共培养作为最佳的体外实验模型。单克隆集落形成实验同样显示，10 μmol/L二甲双胍在体外可显著抑制单个Wnt+细胞自我更新形成单克隆（P＜0.001，图1B）。进一步，通过二甲双胍处理接种不同数量级的Wnt+细胞的小鼠，体内有限稀释实验显示二甲双胍可以抑制Wnt+细胞形成移植瘤的数量，并显著降低肿瘤起始细胞（TICs）的数量（P＜0.001，表2）。

图1 二甲双胍体外对结直肠癌干细胞和癌分化细胞的自我更新能力的影响Fig.1 Evaluation of self-renewal capacity of CSCs and differentiated cancer cells obtained from PDOs following metformin treatment. A: Sphere formation assays of Wnt+ and Wnt- cells treated with different concentrations of metformin. B: Colony formation assays of Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.(**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group).

表2 小鼠体内有限稀释实验检测二甲双胍对结直肠癌干细胞成瘤能力的影响Tab.2 Limiting dilution assays on tumor-initiating frequencies(TIFs)of metformin-treated colorectal CSCs in vivo

2.2 二甲双胍促进Wnt+细胞分化为癌分化细胞

用10 μmol/L二甲双胍处理纯化的CSCs 3 d后，用流式细胞仪检测Wnt+细胞比例变化，结果显示二甲双胍可显著降低Wnt+细胞的比例（P＜0.01，图2A）。qRT-PCR分析显示，二甲双胍显著抑制Wnt+细胞中干性相关标志物CD133、Lgr5、CD44的mRNA水平，显著升高Wnt+细胞中癌分化细胞相关标志物MUC2、KRT20和FABP2的mRNA水平（P＜0.05，图2B）。进一步分析Wnt+细胞中GFP 的荧光强度，结果显示二甲双胍能显著抑制Wnt+细胞中Wnt 信号通路活性（P＜0.001，图2C）。qRT-PCR实验证实，二甲双胍能显著抑制Wnt+细胞Wnt下游信号通路c-Myc、CCND1、ASCL2和AXIN2的mRNA水平（P＜0.05，图2D）。

图2 二甲双胍抑制结直肠癌干细胞Wnt信号通路并促进其分化Fig.2 Metformin inhibits Wnt activity of CSCs and induces CSCs into differentiated cancer cells.A, C: FACS analysis on Wnt expression in 10 μmol/L metformin-treated CSCs and GFP intensity of residual Wnt+cells.B,D:qRT-PCR analysis of changes in cancer stemness-related markers,differentiation-related markers and Wnt target genes in Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

2.3 二甲双胍对结直肠CSCs糖代谢活性的影响

通过海马能量代谢分析仪分析显示10 μmol/L二甲双胍处理Wnt+细胞后，其基础呼吸和氧化磷酸化的OCR均显著下降（P＜0.001，图3A）。同时，其ECAR水平显著增加（P＜0.001，图3B）。TMRE探针检测线粒体膜电位显示，二甲双胍能显著降低Wnt+细胞线粒体膜电位（P＜0.001，图3C）。MitoSOX 探针检测显示，二甲双胍显著抑制Wnt+细胞内线粒体ROS 的产生（P＜0.001，图3D）。

图3 二甲双胍抑制结直肠癌干细胞的线粒体有氧代谢并降低细胞内ROSFig.3 Metformin impairs mitochondrial aerobic capacity and ROS production in colorectal CSCs.A, B: Seahorse analysis for OCR and ECAR of 10 μmol/L metformintreated Wnt+cells.C,D:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/Lmetformin-treated Wnt+cells.***P＜0.001 vs control group.

2.4 二甲双胍促进结直肠癌干细胞分化及机制

体外细胞球体形成实验显示，半乳糖显著增强Wnt+细胞体外自我更新形成细胞球体的能力，二甲双胍或外源性抗氧化剂NAC均能显著抑制Wnt+细胞的细胞球体形成能力，二甲双胍能显著削弱半乳糖促进Wnt+细胞形成细胞球体的效应（P＜0.05，图4A、B）。MitoSOX探针检测证实，半乳糖显著增强Wnt+细胞线粒体ROS水平；加入二甲双胍或外源性抗氧化剂NAC均能显著抑制Wnt+细胞ROS 水平，二甲双胍能显著削弱半乳糖增强Wnt+细胞ROS水平的效应（P＜0.01，图4C）。进一步流式细胞学分析各组Wnt+细胞比例及其细胞内Wnt信号通路活性显示，半乳糖显著增加细胞球体中Wnt+细胞比例及其Wnt活性，二甲双胍和NAC均能显著降低细胞球体中Wnt+细胞比例及其Wnt活性；并且，二甲双胍可显著削弱半乳糖增强Wnt+细胞比例及Wnt活性的效应（P＜0.05，图4D、E）。

图4 二甲双胍通过降低结直肠癌干细胞线粒体ROS抑制其自我更新Fig.4 Metformin inhibits self-renewal capacity of colorectal CSCs by reducing mitochondrial ROS.A,B:Representative images(Original magnification: ×200) and quantitative analysis of sphere-formation capacity of Wnt+ cells treated with 10 mmol/L galactose(Gal),10 μmol/L metformin(Met),5 mmol/L NAC and 10 mmol/L galactose plus 10 μmol/L metformin.C:FACS analysis for mitochondrial ROS production in Wnt+cells.D,E:FACS analysis on Wnt expression and GFP intensity of Wnt+cells in spheres.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Gal group.

2.5 二甲双胍调控结直肠癌干细胞Wnt信号通路的机制

免疫印迹检测显示，人结直肠癌类器官细胞不表达NDI1，转染NDI1 慢病毒后细胞可稳定表达NDI1（图5A）。TMRE探针和MitoSOX探针检测分析显示，10 μmol/L二甲双胍显著抑制结直肠Wnt+细胞线粒体膜电位及细胞内ROS水平，转染NDI1可显著削弱二甲双胍抑制结直肠CSCs线粒体氧化磷酸化及ROS的效应（P＜0.001，图5B、C）。荧光显微镜观察及流式细胞检测显示，10 μmol/L二甲双胍显著降低PDOs中Wnt+细胞的比例及其Wnt信号通路活性，转染NDI1可显著削弱二甲双胍降低结直肠CSCs的比例、抑制其Wnt信号通路活性的效应（P＜0.001，图5D、F）。

图5 二甲双胍抑制线粒体复合体I抑制结直肠癌干细胞Wnt/β-catenin信号通路Fig. 5 Metformin suppresses Wnt/β-catenin signaling pathway of colorectal CSCs by inhibiting mitochondrial complex I.A:Western blotting for NDI1 expressions in Wnt+cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus.B,C:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/L metformin-treated Wnt+ cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus. D-F: Representative images and FACS analysis of Wnt expression and GFP intensity in NDI1 lentivirus or vector lentivirus-infected Wnt+ cells derived organoids (Scale bar: 100 μm).***P＜0.001 vs control group,###P＜0.001 vs vector lentivirusinfected organoids treated with 10 μmol/Lmetformin.

3 讨论

二甲双胍是经典的治疗糖尿病的药物，其潜在的预防和抗结直肠癌的作用也引起了广泛的研究兴趣［9-13］。然而，其发挥作用的对象和机制仍缺乏不清楚［19,20］。本研究首次使用人原代结直肠癌PDOs作为研究对象，探讨临床治疗浓度（5～30 μmol/L）的二甲双胍对不同肿瘤和不同细胞亚群的抑制效应［21,22］，结果发现二甲双胍对抑制结直肠CSCs体外自我更新形成细胞球体的效应呈浓度依赖性，对癌分化细胞无显著影响。同时，二甲双胍可显著降低CSCs相关基因和Wnt信号通路下游基因的mRNA表达水平，显著升高癌分化细胞相关基因的mRNA水平。既往体内研究数据仅发现二甲双胍降低CSCs形成肿瘤的体积或生长速度，无法排除二甲双胍对增殖的抑制效应［20-23］，本研究率先通过小鼠体内有限稀释实验计算可形成肿瘤细胞的数量，证实二甲双胍在体内显著降低结直肠CSCs亚群中的可成瘤细胞频率，抑制CSCs自我更新形成肿瘤。以上数据证实，二甲双胍选择性抑制结直肠CSCs并促进其分化为癌分化细胞亚群。

二甲双胍可以通过抑制线粒体氧化磷酸化发挥其抗肿瘤作用［24］。研究表明，结直肠CSCs较癌分化细胞具有更高的氧化磷酸化和ROS水平，ROS可以增强介导CSCs自我更新的Wnt/β-catenin信号通路［7,8,25］。因此，我们进一步探讨了二甲双胍对结直肠CSCs葡萄糖代谢和ROS水平的影响，结果显示二甲双胍显著降低结直肠CSCs的细胞OCR、线粒体膜电位水平和ROS水平，显著增强其ECAR，证实二甲双胍可抑制结直肠CSCs氧化磷酸化及下游ROS的产生，并促进其代谢重编程至糖酵解产生更多的酸性代谢产物。加入外源性半乳糖增强细胞氧化磷酸化、升高ROS水平［26］，能显著增强结直肠CSCs自我更新能力和Wnt信号通路活性，加入抗氧化剂NAC降低ROS水平能显著削弱结直肠CSCs自我更新能力和Wnt信号通路活性；并且，二甲双胍能显著削弱半乳糖增强结直肠CSCs的线粒体氧化磷酸化和ROS 水平的效应，从而抑制半乳糖对Wnt/βcatenin信号通路的促进作用。以上数据表明，二甲双胍通过抑制线粒体氧化磷酸化及下游ROS的生成降低结直肠CSCs的Wnt/β-catenin信号通路。

二甲双胍通过抑制线粒体复合体I发挥其临床治疗作用［27］。我们将酵母NADH脱氢酶NDI1转染至结直肠癌PDOs，其在细胞内可替代人线粒体复合体I的功能且不受二甲双胍的抑制，从而维持线粒体的有氧代谢和ROS水平［28］。转染NDI1后，二甲双胍失去降低结直肠CSCs氧化磷酸化和ROS水平的作用，与文献报道一致［12］。流式细胞学分析显示，转染NDI1可挽救二甲双胍降低结直肠CSCs 比例和Wnt 活性水平的效应。表明二甲双胍通过抑制线粒体复合体I下调CSCs的Wnt/β-catenin信号通路。

目前结直肠癌和卵巢癌的临床研究均已发现，术前服用二甲双胍可显著降低肿瘤内CSCs的比例，提示二甲双胍在靶向抑制CSCs中有重要的应用前景［29,30］。本研究证实了二甲双胍通过抑制结直肠CSCs的线粒体复合体I降低结直肠CSCs线粒体氧化磷酸化水平，从而通过抑制ROS/Wnt/β-catenin 信号通路降低结直肠CSCs的自我更新能力，为探索应用二甲双胍治疗结直肠癌提供了新的理论依据。