1型糖尿病可能增加甲状腺毒症的风险：基于两样本孟德尔随机化方法

占雯婕，赵玲

1广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510006；2广州中医药大学第二附属医院，广东 广州510006

甲状腺毒症是组织和循环中甲状腺激素水平过高的总称，分为与甲亢相关的甲状腺毒症和非甲亢相关的甲状腺毒症。在碘充足地区，非医源性甲状腺毒症最常见的原因是格雷夫斯病（GD），约占80%。目前认为，GD发病风险主要与遗传因素有关，许多与GD风险增加的相关基因与其他自身免疫性疾病（如T1DM）相关基因重叠［1］。在中国，临床甲亢患病率0.78%、亚临床甲亢0.44%、GD患病率0.53%。未经治疗的甲亢甚至亚临床甲亢可导致心房颤动、卒中和其他心血管事件以及骨质疏松症和骨折的发生风险增加［2］。T1DM是一种慢性自身免疫性疾病，以胰岛素缺乏和高血糖为特征［3］，T1DM的患病率在全球范围内呈上升趋势，全球患病率为每万人9.5例［4］。许多观察性研究发现，T1DM和甲状腺毒症密切相关，印度的一项横断面研究显示，130名GD患者中，3.1%伴有T1DM［5］；英国的一项横断面研究发现，2791例GD患者种1.11%伴有T1DM［6］；一项1993年到2010年的前瞻性研究表示，在3209名白种人GD患者中，观察到T1DM明显高于对照组［7］。但是上述研究未能说明二者因果关系，且观察性研究易受到反向因果关系和混杂因素干扰，从而使因果关系推断受限。

孟德尔随机化（MR）分析方法近年被广泛用于流行病学的因果关系研究。MR研究的基本原理是配子形成中亲代等位基因随机分配给子代，相当于对人群进行随机分组，与随机对照试验类似［8］。由于遗传变异出生时即固定并且伴随一生，因此MR研究能最大限度减少反向因果关系［9］。将遗传变异作为工具变量（IVs）对暴露因素与结局的因果关系进行推断，能减少混杂因素的干扰［10］。

以往的T1DM和甲状腺毒症研究大多是基于观察性的研究，容易受混杂因素或者反向因果关系的影响，而MR分析能最大限度避免二者干扰，但目前尚未有T1DM和甲状腺毒症的MR分析。本研究运用两样本MR方法，以单核苷酸多态性（SNPs）作为IVs，研究T1DM和甲状腺毒症之间的因果关系。由于甲状腺激素过多会影响患者血糖控制、损伤胰岛细胞功能以及降低胰岛素敏感性［11］，因此明确二者关系，不仅有助于尽早发现并及时治疗甲状腺毒症，减轻甲状腺毒症导致的危害，也有助于糖尿病患者更好地控制血糖。同时，本次研究为T1DM和甲状腺毒症之间的因果关系提供了统计学上的线索，为实验研究和机制探索提供了理论依据。

1 资料和方法

1.1 研究设计

本文利用T1DM作为暴露因素，与T1DM显著相关的SNPs作为IVs，结局变量为甲状腺毒症。剔除离群值后，运用两样本MR分析的方法进行因果分析，并进异质性检验和多效性检验，最后对结果的可靠性进行检验。

MR研究中的IVs需满足三个核心假设：（1）IVs与暴露因素高度相关；（2）IVs仅通过暴露因素影响结局，不与结局直接相关；（3）IVs与“暴露-结局”关联的混杂因素无关（图1）。

图1 两样本MR研究示意图Fig. 1 Model of the two-sample Mendelian randomization(MR)analysis.

1.2 资料来源

通过https://gwas.mrcieu.ac.uk/网站分别获取T1DM和甲状腺毒症的GWAS。其中T1DM数据来源于EBI GWAS 数据库，甲状腺毒症数据来源于芬兰FinnGen数据库，以上数据人源均来自欧洲（表1）。

表1 两样本MR研究GWAS数据简要信息Tab.1 Summary of the GWAS included in this two-sample MR study

1.3 IVs的筛选

依据MR的核心假设进行IVs筛选。以欧洲千人全基因组为参照，设置P＜5×10-8筛选与T1DM有显著意义的SNPs，以满足关联性假设。使用R4.2.2 软件的TwoSampleMR包进行clump计算，设置参数r2=0.001，kb=10 000，以排除连锁不平衡的影响，保证SNPs之间相互独立［12］。从甲状腺毒症的GWAS数据中提取上述与T1DM密切相关的SNPs，对两者进行整理合并。利用MR-PRESSO进行离群值检验以去除水平多效性［13］，删除离群值同时剔除与甲状腺毒症直接相关的SNPs（P＜5×10-8）［14］。

1.4 统计学处理

1.4.1 T1DM与甲状腺毒症的因果效应估计 主要采用逆方差加权法（IVW）［15］进行MR分析，用MR-Egger回归［17］、加权众数法（WM）［17］和加权中位数法（WME）［18］进行补充。IVW主要用于因果关系估计，其估计值可视作结局中的IVs在暴露因素中加权线性回归的斜率，且截距项视为0，当所选SNPs都是有效的IVs时，IVW可以提供准确的估计值［15］。MR-Egger法同样以斜率作为因果效应估计值，但是该法考虑截距项的存在，且其截距可用于评估IVs之间的多效性［16］。WM方法根据因果效应的相似性将SNPs聚类为子集，进而估计具有最大数量SNPs的子集的因果效应［17］。WME法在无效IVs高达一半时，仍能提供一致性的因果效应估计值［18］。采用IVW和MR-Egger法对IVs进行Cochran Q和Rücker Q异质性检验［19,20］。

1.4.2 可靠性评价

1.4.2.1 多效性检测 多效性检验目前普遍采用MREgger回归的截距项来表示，当该截距项接近于0时，表示不存在多效性，可认为排他性假设成立［21,22］。

1.4.2.2 敏感性分析 采用逐个剔除检验进行敏感性分析［23］。该法逐一剔除SNPs后计算剩下SNPs的结果，若剔除某一SNPs后结果改变很大，说明该SNPs对结果影响很大。

1.4.3 弱IVs检验 分别计算单个SNPs的F值，对所选IVs进行弱IVs偏倚检验。F=β2exposure/SE2exposure，β为暴露的等位基因效应值，SE为暴露的标准误［24］。

上述方法均通过R4.2.2软件的TwoSampleMR包实现，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 筛选出的IVs

经过相关性和去除连锁不平衡筛选后，得到44个SNPs，合并整理并删除缺失项后，得到37个SNPs，经MR-PRESSO检验得到5个离群值，删除离群值最终得到32个SNPs（表2）。

表2 MR分析SNPs信息表Tab.2 Basic information of the single nucleotide polymorphisms(SNPs)

2.2 两样本MR结果

IVW法结果显示，OR值及95%CI均＞1，且P值＜0.05，具有显著统计学意义（OR=1.077，95%CI：1.046～1.109，P=7.201×10-7），即说明整体人群中T1DM与甲状腺毒症具有正向的因果关系。MR-Egger 回归、WM和WME 计算的T1DM 与甲状腺毒症之间的OR 值、95%CI和P值分别为（OR=1.076，95%CI：1.031～1.124，P=0.002）、（OR=1.082，95%CI：1.048～1.118，P=4.375×10-5）、（OR=1.090，95%CI：1.052～1.129，P=2.003×10-6）（图2）。MR-Egger回归、WM和WME与IVW所得效应值及区间范围趋于一致，P值均有统计学意义，四种算法得到的因果效应方向一致（图3），均显示T1DM是甲状腺毒症的危险因素。

图2 两样本MR结果森林图Fig. 2 Forest plot of the two-sample MR analysis.

图3 两样本MR结果散点图Fig. 3 Scatter plot of the two-sample MR analysis.

2.3 异质性检验

异质性检验中，Cochran Q 检验和Rücker Q 检验结果分别为P=0.127和P=0.155，表明IVs间不存在异质性。

2.4 可靠性评价

2.4.1 多效性检测 MR-Egger 回归的截距Eggerintercept=0.0004，P=0.965，表明因果效应分析结果并未受到多效性干扰，可认为排他性假设成立。

2.4.2 敏感性分析 经逐个剔除检验，依次剔除单个SNPs，余下的31个SNPs分析结果与纳入全部SNPs的IVW分析结果相近，且都在无效线右侧（图4），说明本次MR分析结果是稳健的。漏斗图显示使用单一SNPs作为IVs时，代表因果关系效应的点大致呈对称分布，表示受潜在偏倚影响的可能性小（图5）。

图5 两样本MR结果漏斗图Fig. 5 Funnel plot of the two-sample MR analysis.

2.5 弱IVs检验

当F＞10时，出现弱IVs的可能性比较小［25］。本次32个SNPs的F值范围在30.540～1465.470，无弱IVs偏倚，进一步验证了MR研究的关联性假设（表2）。

3 讨论

本次两样本MR分析验证了T1DM与甲状腺毒症之间的关联，IVW法、MR-Egger回归、WM和WME四种方法分析显示，T1DM与甲状腺毒症之间存在因果关系，且因果效应保持稳定。

一项12年全国范围、基于人群（中国台湾青少年和儿童）的回顾性队列研究显示，T1DM中甲状腺毒症的发生率显著高于对照组，发病率比为6.95［26］。一项纳入了761例东亚T1DM患者的前瞻性研究表明，4.1%的患者出现了GD［27］。美国一篇甲亢文章指出，甲状腺毒症的高危人群包括T1DM患者，并建议进行甲状腺毒症筛查［28］。

T1DM引起甲状腺毒症的机制很复杂，目前研究显示与自身免疫和遗传因素密切相关。GD和自身免疫性甲状腺炎是自身免疫性甲状腺疾病（AITD）的两种主要临床表现［29］。T1DM和AITD是两种常见的自身免疫性内分泌疾病，AITD常和其他自身免疫病相关，其中最常见的是T1DM［7,25］。虽然两种疾病的发病机制存在差异，但流行病学数据显示，T1D和AITD在同一个体和家庭中存在聚集性，这表明这两种疾病具有共同的遗传基础［4］。高达25%的青少年T1DM患者有甲状腺相关抗体，长期随访显示，30%的T1DM患者会发展为AITD［4］。美国糖尿病协会(ADA)也描述了T1DM患者中17%～30%的AITD患病率［29］。目前研究发现，某些HLAII类自身等位基因的携带，与最常见的自身免疫性疾病发病概率的增加存在关联，经遗传学研究已经证实，少数基因同时具有患AITD 和T1DM 的风险。HLA-dr3 是导致AITD 和T1DM 联合易感性的主要HLA II类等位基因，HLA-dr有独特的氨基酸特性，胰岛肽和甲状腺肽都能与之结合，并诱导甲状腺和胰岛特异性T 细胞反应，从而在同一个体中触发T1DM 和AITD［4］。除了HLA类基因外、CTLA-4、PTPN22、IL2Ra、VDR、TNF也被认为是潜在的遗传易感性位点［26］。然而不同人群对于基因易感性具有差异，如在阿拉伯和亚洲人群中，HLA易感等位基因与在欧洲和美国白种人人群中发现的不同，部分基因对T1DM和AITD的影响机制亦尚未阐明，未来还需要进一步研究。

由于甲状腺毒症会增强肝糖原异生，增加胰岛素抵抗，使T1DM患者的血糖难以控制稳定，甚至可能导致酮症酸中毒，积极治疗甲状腺毒症,抑制甲状腺激素过多对T1DM患者糖代谢调节有重要意义。由于早期甲状腺毒症症状缺乏特异性，T1DM患者要及时进行相关检查，以免漏诊、误诊。甲状腺毒症的早发现早治疗，也有助于降低其带来的心血管事件及骨质疏松的发生风险。

本研究具有如下创新性：（1）以大样本GWAS数据为基础，从遗传学角度探讨了T1DM与甲状腺毒症的因果关系，和以往的观察性研究相比不易受混杂因素和反向因果关系干扰；（2）SNPs的筛选比较严格，对结局影响较大的SNPs进行了剔除，并运用了MR-PRESSO删除了离群值；（3）采用了4种MR分析方法，运用2种方法进行异质性检验、3种方法进行了可靠性评价，结果比较稳健。

本次MR研究存在的局限性：（1）纳入对象为欧洲人群，结论外推到其他人群中受限；（2）难以根据GWAS汇总数据按照性别、年龄、既往史进行分层分析；（3）本研究为统计学结果，无法进一步探讨其中机制。后续研究还需在不同人种之间展开，并对不同性别、年龄的人群开展进一步分层研究，以进一步探索T1DM对甲状腺毒症的影响。

综上，本研究采用两样本MR方法，对T1DM和甲状腺毒症之间的因果关系进行探究，结果表明T1DM可能会增加甲状腺毒症的风险。