桃花花型（铃形/蔷薇形）基因型鉴定、分子标记开发与利用

吉爽秋 王力荣 李勇 朱更瑞 曹珂 方伟超 陈昌文 王新卫 张琦 吴金龙

摘要：【目的】进一步完善桃花型基因型分类，开发桃花型相关分子标记，为观赏桃花的分子辅助育种提供理论支持。【方法】利用全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）、IGV可视化软件分析，以及竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele-specific PCR，KASP）技术，在定位到的候选位点进行鉴定分析。【结果】GWAS定位分析在Pp08：14 518 604～14 521 291 bp 存在一个ms179810 转座子的缺失，x2验证结果表明，转座子的插入与缺失与花型性状无显著性关系。在转座子上游33 980 bp 处鉴定到一个单碱基核苷酸（SNP）变异，变异类型分为CC型、AC型、AA型3 种，比对结果显示基因型为CC型、AC型，其表型为铃形，基因型为AA型，其表型为蔷薇形，在145 份桃自然群体中鉴定准确率为98.62%。但是通过表型比对发现，基因型为CC时，铃形花冠直径为（1.54 ± 0.46）cm，同时，基因型杂合的中蟠17 号自交群体后代192 株中基因型与表型准确率在98.44%。【结论】根据桃基因组中Pp08：14 484 624 bp处的变异类型以及桃花型的调查结果，首次将铃形花基因型细分为纯合铃形和杂合铃形，且开发了同时鉴定纯合铃形、杂合铃形及蔷薇形的分子标记。

关键词：桃；花型；全基因组关联分析（GWAS）；IGV；竞争性等位基因特异性PCR（KASP）

中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）03-0422-10

桃（Prunus. persica L.），蔷薇科，李属，多年生自花授粉落叶果树。因其染色体数目少（2n=16），基因组小（227 Mb），童期短，被认为是蔷薇科果树研究的模式植物[1]。中国是桃的起源中心，种质资源遗传多样性丰富。观赏桃是桃种质资源的重要类型。其花型主要分为铃形、蔷薇形和菊花形（图1），在三大花型的基础上，通过育种技术的不断更新，花型、花色、树形、枝形和叶色的交叉组合，赋予桃花更多的表现形式[2-3]。

铃形和蔷薇形是一对等位基因控制的质量性状。铃形花冠直径小，花瓣细长，完全开放时形似铃铛；蔷薇形花冠直径大，花瓣肥硕，开放时花瓣展开，在外观上容易区分表型，且该性状属于质量性状，定位分析相对简单，因此前人对此做了大量的研究，例如，在2009 年Ogundiwin 等[4]利用罐桃品种Dr. Davis和鲜食桃品种Georgia Belle 的F1群体，构建了一个包含211 个标记的遗传连锁图谱Pop-DG，将铃形/蔷薇形关联位点定位于8 号染色体34.4 cM处；2010年Fan 等[5]利用QTL定位将桃花铃形/蔷薇形定位在8 号染色体上的CPPT006 与PacC13 两个标记之间。之后随着GWAS 定位技术在果树分子育种上的发展，2015 年Micheletti 等[6]基于9K SNP 芯片对1580 份桃种质资源进行GWAS分析，发现8 号染色体18 个SNP 标记与铃形/蔷薇形关联紧密，范围大小为4.3 Mb；2016 年Cao 等[7]利用129 份桃种质材料，在8 号染色体13 740 117 bp处发现的1个SNP位点与铃形/蔷薇形关联度较高；2021 年孟歌等[8]利用199 份桃种质，将铃形/蔷薇形定位在8 号染色体14 484 624 bp处，并开发了相应的分子标记；2022 年Lian 等[9]利用黄水蜜×中油桃14 杂交后代81 株，在8号染色体PpB3-1 基因启动子区发现了1 个与表型关联度极高的SNP。目前开展的花型定位分析绝大多数利用的数据是SNP基因型，将控制桃花型的候选基因范围锁定在8 号染色体14 Mb～16 Mb之间，但是基于SNP的GWAS结果定位区间往往较大，区间内的变异位点较多，开展关键基因挖掘工作仍具挑战性。而变异的SV（Structure Variantions）较SNP而言，更能影响基因的功能[10]。因此笔者利用本课题组前期发表的327 份桃种质材料的重测序结果，利用鉴定到的SV 位点进行全基因组关联分析（GWAS），将候选基因的范围锁定在14.4 Mb～14.6 Mb之间，并挖掘到1 个与表型相关性极高的SNP 位点Pp08：14 484 624 bp，利用KASP 基因分型技术验证了该位点的准确性，同时在与表型的验证过程中首次提出纯合铃形/杂合铃形之分，为进一步克隆关键基因提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

用于本试验GWAS分析的材料主要源于327 份桃种质材料，具体品种参考Guo等[11]，用于转座子验证的材料主要来源于1 个192 株的自交群体，2 个96株的杂交群体，自交群体为中蟠17 号，杂交群体为瑞光39 号×08-9-106 和晴朗× 中油蟠7 号，用于IGV可视化分析的145 份桃种质材料（表1），其中有59份为GWAS 已有重测序数据，86 份新增重测序数据。以上种质资源及自交和杂交群体后代均来自国家园艺种质资源库和中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃。

1.2 表型数据的调查

2022 年3、4 月对自然群体及杂交群体的表型进行调查。具體调查结果如表2 所示。

1.3 DNA提取与测序

样品DNA的提取采用改良的CTAB法，具体方法参考张南南等[12]的方法，DNA 质量用NanoDrop1000 spectrophotometer（Themo Scientific）紫外分光光度仪检测。用于KASP 基因分型的样品DNA质量浓度调整至50～100 ng·μL。用于GWAS定位分析的DNA纯化后构建文库和测序，文库大小为350 bp，测序平台选用Hiseq X Ten（Illumina），测序任务由安诺优达基因科技有限公司（北京）完成。经数据质控后（FastQC），每个样本产生至少5 Gb的数据[11]。

1.4 全基因组关联分析

利用SV数据开展GWAS分析，最终产生181 381个变异位点，定位出铃形/蔷薇形相关的变异位点，并曼哈顿（Manhattan）图显示关联位点。

1.5 IGV可视化分析

利用IGV可视化查看基因组重测序结果，比对文件为下机的bam文件，导入IGV的bam文件附加samtools 文件，生成3 个相关的tracks，AlignmentTrack，Coverage Track，Splice Junction Track，对145份桃品种基因组序列进行比对。

1.6 KASP标记分型

竞争性等位基因特异性PCR（KASP）扩增体系：5 μL 2× KASP master mix（广州固德生物技术有限公司，广州，中国），1 μL DNA 样品，0.5 μL混合引物以及3.5 μL水，添加混合试剂前加入等体积石蜡油封体系。KASP 扩增程序如下：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性20 s，61～55 ℃复性延伸60 s，10 个循环，每个循环复性延伸温度降低0.6 ℃；95 ℃变性20 s，55 ℃复性延伸60 s，32 个循环。荧光数据读取和分析仪器为Roche LC96 Ⅱ（Roche Diagnostics，USA），读取温度为37 ℃，读取时间为60 s，所用荧光为羧基荧光素（FAM，carboxy fluorescein）和六氯荧光素（HEX，hexachlorouorescein）。KASP 引物序列信息见表3。

2 结果与分析

2.1 铃形/蔷薇形性状关键位点全基因组关联分析

笔者在本研究中通过对327 份桃材料进行重测序分析，利用SV变异定位铃形/蔷薇形候选区间，在桃全基因组中共获得181 381 个高质量SV 位点。GWAS 结果发现在Pp08：14 518 604～14 521 291 处有一个2866 bp 转座子（TE）与花型显著相关（图2），缩短了前人的定位区间。PCR扩增该转座子后，用1%的琼脂糖凝胶电泳在23 份种质资源（图3）和384份杂交群体后代中进行验证（表4）。发现在23 份桃种质中没有差异，在384 份杂交群体后代中虽然存在分离，但x2检验结果却表明转座子的插入与缺失与花型无显著的相关性。

2.2 IGV可视化分析挖掘变异关键位点

由于转座子的插入与花型之间没有显著性关系，且该定位区间附近基因数量较少，从而在原有的定位基础上，扩大定位区间，在定位区间前后100 kb 的范围内，利用IGV软件，以Prunuspersica-genome.v2.0.a1作为参考基因组，在145份桃种质材料重测序数据中比对分析，发现在转座子上游33 980 bp 处存在一个变异的SNP（C→A），该位点为Pp08：14 484 624 bp，经比对发现，该位点存在3种变异类型，如图4-a～c所示，图4-a位点为CC时，表现为铃形花，图4-b位点为AC时，表现依然为铃形花，图4-c位点为AA时，表现为蔷薇形花。但是通过与表型比对发现，位点为CC时的铃形花冠直径比位点为AC的更小，位点为CC时花冠直径为（1.54±0.46）cm，位点为AC时花冠直径为（2.61±0.4）cm。因此笔者认为，在花型的分类中，铃形花又可以分为纯合铃形和杂合铃形。

2.3 KASP基因分型技术鉴定纯合铃形种质

由于铃形/蔷薇形是由一对等位基因控制的质量性状，根据孟德尔遗传规律，变异位点为AC的铃形花自交后代应该出现以上3种花型的分型。因此采用该位点基因型为AC的中蟠17号，利用其自交群体后代192株，对Pp08：14 484 624 bp进行KASP基因分型验证，发现中蟠17号自交群体有3种基因型（图5），分离比为41∶94∶54，接近1∶2∶1。对中蟠17号自交群体的花冠直径进行了调查统计（图6），花冠直径被分为（1.54±0.46）cm、（2.61±0.4）cm、大于3.7 cm 3种类型，分别为纯合铃形、杂合铃形、蔷薇形，与基因型比对正确率在98.44%（表5）。对所得结果进行聚类分析（图7），发现纯合铃形和杂合铃形关系更近，较蔷薇形关系较远。

3 讨论

在花型分类中，育种家更倾向于培育花冠直径大且重瓣的蔷薇形花，比如：洒红龙柱、报春、迎春、满天红等[13-16]。花冠直径大小也一直被认为是区分铃形/蔷薇形的标准之一，因此开发控制花型的分子标记，对观赏桃花分子育种具有重要指导意义。有研究推断花的大小进化轨迹是从小花到大花，此过程要经过多年的遗传变异和自然选择[17-18]。

Landis 等[19]的研究发现，黄花菜种群的花从种质的起源到现在变大了2.5 倍；Mojica 等[20]的研究发现，在自然变异中，大的菊花需要花费2000 年的时间才能从小的菊花突变而来。花型是影响交配系统进化和繁殖成功的一个关键生态性状，传粉者、天敌和非生物环境是花型变异的驱动力，花型差异通常与不同的传粉者有关，形成传粉综合征[21]，花型一直被认为是操控传粉者的一种适应方式[22-23]，促进花型向着大花型的方向进化，更有利于传粉者授粉。但是一些物种花形态的差异往往不符合这一推断，有研究发现，自交群体的起源是和他们祖先非常接近的杂交群体，从异花授粉到自花授粉伴随着花的形态学向“自交综合征”的显著变化，其特征就是花的大小缩小，花的性状大多数变异是由群体遗传变异而来，但是花形态上的某些差异可能归因于一个单独的进化史[24]。桃就是典型的自花授粉植物，虽然铃形对蔷薇形为显性，但是上海水蜜作为栽培桃的祖先[25-26]，其花型为蔷薇形，并且有研究报道GF677（蔷薇形）与红根甘肃桃1 号（蔷薇形）杂交，后代出现了广泛的分离，F1代出现了铃形花，因此铃形花可能是桃、扁桃与甘肃桃种间杂交而来的[27]。综合桃花的发展和进化史，从而推断铃形花可能从蔷薇形花中突变而来。研究桃花型的进化史，首先需明确控制花型的关键基因，尽管此前对于铃形/蔷薇形的定位做了大量研究，将关键基因定位在8 號染色体14 Mb～16 Mb之间，但具体位置一直存在差异。笔者在本研究中利用基于SV 的GWAS 分析，最显著的信号位于8 号染色体ms179810 转座子，x2检验结果却表明转座子的插入与缺失与花型没有显著的相关性，但在该定位区间挖掘到一个与表型相关度极高的SNP（Pp08：14 484 624 bp），经查阅文献资料，孟歌等[8]利用199 份桃资源，筛选到1 042 687 个SNP标记，利用GWAS 分析找到同样的位点，经鉴定与表型的准确率在93.46%。笔者通过改进引物、增加验证群体，提出并验证了纯合铃形的存在，因此该标记在桃自然群体中表型符合率在98.62%，在杂交群体中表型准确率在98.44%，证明该位点不仅可作为区分铃形/蔷薇形的分子标记，还可以作为区分纯合铃形/杂合铃形的分子标记。

4 结论

笔者根据桃基因组Pp08：14 484 624 bp 处的变异类型以及桃花型的调查结果，首次将铃形花细分为纯合铃形和杂合铃形，且开发了同时鉴定纯合铃形、杂合铃形及蔷薇形的分子标记。纯合铃形种质资源的鉴定，为鉴定与挖掘提供新的实验材料，推动了桃花型的研究进展。

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