介质阻挡放电等离子体对不同pH值生长的酸土脂环酸芽孢杆菌的灭活作用

陈琳，陈缘，何亮亮，李万华*，汪浪红,*，曾新安

（1.西北大学食品科学与工程学院，陕西西安 710069）（2.佛山科技学院广东省食品智能制造重点实验室，广东佛山 528225）（3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，A.acidoterrestris）是一类非致病性、产芽孢的嗜酸耐热菌，大量研究表明这类细菌是引起苹果汁、橙汁等酸性果汁腐败的主要原因之一[1-3]。被脂环酸芽孢杆菌污染的果汁在初期并不出现明显酸败或涨包现象，很难直接观察到，但其代谢产物如愈创木酚、2,6-二溴苯酚以及2,6-二氯苯酚会使果汁出现口感和风味变劣、浊度升高等质量问题[4]，进而给生产企业带来巨大的经济损失。巴氏灭菌处理（70～90 ℃）是果汁加工中最常见的杀菌手段，但是很难将其完全杀灭[5,6]。鉴于其危害性，脂环酸芽孢杆菌被认为是果汁加工中需控制的关键微生物之一[7]。因此，如何有效杀灭果汁中的脂环酸芽孢杆菌对于我国果汁行业的发展具有重要意义。

非热等离子体技术是由电离或部分电离的气体所产生的原子、电子、带电粒子、自由基、紫外线光子形成的集合体[8]。等离子体能够在低温短时间杀灭食品中的各种微生物，近几年被广泛运用于果汁、快餐食品、肉类制品等各类食品灭菌[9-11]。研究表明，细菌在遭受不良的环境状况如低温、酸或碱以及食品加工或储存中的高盐胁迫后会引入应激反应并通过相应的代谢过程对其产生耐受性[12]。根据同源耐受性原理，产生适应的细菌会对同一胁迫条件产生更高的耐受性[13]。另外，遭受胁迫的细菌可能还会诱发交叉耐受性反应，进而产生对不同的条件如酸、热环境产生高耐受性[14,15]。果汁是一种高酸环境体系（pH值为3.2～5.0），不同的酸性环境对脂环酸芽孢杆菌造成酸胁迫，并引起应激反应。然而，pH值介导下的酸土脂环酸芽孢杆菌对等离子体的耐受性的高低并未见相关报道。

因此，本文从酸土脂环酸芽孢杆菌在不同pH值下的生长速率、形态变化，并基于气相-质谱联用法分析酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜脂肪酸成分的差异，探究pH值介导下酸土脂环酸芽孢杆菌与等离子耐受性之间的关系，本文对于全面了解脂环酸芽孢杆菌在不同pH值下的生长特性及对等离子体耐受性机理具有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 原料

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestrisATCC 49025）采购广东微生物研究所微生物培养物保藏中心提供。细菌脂肪酸甲酯标准溶液，美国Sigma公司。

1.2 主要仪器设备

CTP-2000K等离子体设备（装配DBD-50反应器），南京苏曼有限公司；UV-1800岛津紫外可见分光光度计，日本岛津公司；8890B-7000D气相-质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；扫描电镜仪，日本日立有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与培养

将安瓿管中的酸土脂环酸芽孢杆菌转移至AAM培养基中，于摇床中在45 ℃条件下隔夜培养。用接种环沾取酸土脂环酸芽孢杆菌培养物于固体培养基中进行划线，放置培养箱中于45 ℃温度下培养24.0 h进行菌种活化。将含酸土脂环酸芽孢杆菌培养物接种至新鲜AAM培养基中（pH值3.2、3.6、4.0和4.4），45 ℃下进行培养，并测定其生长曲线。

1.3.2 细胞膜脂肪酸提取与分析

不同pH值下将酸土脂环酸芽孢杆菌培养至稳定初期，离心收集菌体。根据Wang等[16]报道的方法进行膜脂肪酸提取与甲基化，具体方法如下：（1）取菌体40～50 mg加入1.0 mL皂化液（4.5 g NaOH，15.0 mL甲醇，15.0 mL蒸馏水），浸泡在沸水浴中充分混合30 min；（2）冷却至室温后，加入2.0 mL甲基化溶液（32.5 mL 6.0 mol/L HCl和27.5 mL甲醇），80 ℃水浴10 min后冷却至适温；（3）加入1.25 mL的萃取液（正己烷/甲基叔丁基醚，V/V=1:1）充分混合，去除水相；（4）加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH，将一定量的有机相移到气相小瓶，并作气质联用分析。

1.3.3 DBD-等离子体处理

介质阻挡放电等离子体（DBD-ACP）设备原理图如图1所示，产生等离子体的气源为空气。将酸土脂环酸芽孢杆菌培养至稳定初期，离心重悬于等体积的无菌生理盐水和苹果汁之中。取4.0 mL菌液于20 kV和30 kV电压下处理0、0.5、1.0和2.0 min，其中高压电极板和样品表面距离为5 mm，频率为1.0 kHz。处理后的菌液进行梯度稀释并涂布，于45 ℃下培养36.0～48.0 h以检测菌落总数（CFU/mL），根据处理前后菌落数变化分析致死率。每次处理重复三次，实验结果取平均值。

图1 介质阻挡放电（DBD）等离子体处理实验装置原理图Fig.1 Schematic of a dielectric barrier discharge (DBD) plasma treatment experimental device

1.3.4 扫描电镜观察

扫描电镜制样参考之前的方法进行[17]：将不同pH值（3.2、3.6、4.0和4.4）培养的酸土脂环酸芽孢杆菌进行菌体收集（离心，4 000g，5.0 min），并用含2.5%（V/V）戊二醛的PBS缓冲液在4 ℃条件下保存过夜。离心后分别使用φ=30%～100%乙醇溶液对细菌样品进行梯度脱水。脱水后的菌体用叔丁醇处理两次，然后将样品滴在锡箔纸上进行真空冷冻干燥，喷金后即可观察酸土脂环酸芽孢杆菌形态变化。

1.3.5 统计学分析

所有数据均以Origin Pro 8作图，采用SPSS Statistics 22作数据分析分析，结果用平均值±标准差来表示，每组试验平行3次。

2 结果与讨论

2.1 酸土脂环酸芽孢杆菌的生长动力学分析

通过测量OD600nm值绘制生长曲线，研究不同pH值对酸土脂环酸芽孢杆菌生长的影响。如图2所示，不同pH值培养基培养下，酸土脂环酸芽孢杆菌生长速率存在一定的差异。其中，pH值4.0条件下酸土脂环酸芽孢杆菌生长速率最快，培养6 h后即进入生长对数期，20 h后进入生长稳定期。pH值3.6和4.4条件下培养的酸土脂环酸芽孢杆菌生长有轻微的延迟，分别在10 h后和22 h后进入生长对数期和生长稳定期。相比之下，酸土脂环酸芽孢杆菌在pH值3.2下生长被显著抑制，培养16 h后才进入对数生长期，36 h后才进入稳定期。另外，从图中可以看出，到达稳定期后，不同pH值培养下的酸土脂环酸芽孢杆菌的生长总量（OD600nm）存在差异，依次为pH值4.0＞4.4≈3.6＞3.2。不同pH值下生长的菌体总量和生长延迟的现象与Zhao等[18]报道的结果一致，表明不同的pH值培养下对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长总量（OD600）有一定的影响。

图2 不同pH值下酸土脂环酸芽孢杆菌的生长曲线Fig.2 Growth curves of Alicyclobacillus acidoterrestris under various pH

2.2 不同pH值下酸土脂环酸芽孢杆菌的形态变化

采用扫描电镜对菌体形态进行观察，进一步研究不同pH值生长环境对酸土脂环酸芽孢杆菌生长的影响，结果如图3a～d所示。从图3c和d看到，pH值4.0和4.4生长下的酸土脂环酸芽孢杆菌菌体呈现短杆状，为正常形态特征，与之前的文献结果一致[19]；然而酸土脂环酸芽孢杆菌在pH值3.2与3.6生长条件下出现异常伸长，呈现丝状形态，且pH值3.2培养的菌体更为明显。Zhao等[18]也发现低pH值（2.8和3.4）培养下酸土脂环酸芽孢杆菌表现出类似的菌体形态延长的现象。Wehrens等[20]在大肠杆菌上发现42 ℃的培养温度对大肠杆菌进行胁迫，发现细菌能比正常状态下伸长10～20倍，最长能达到40 μm，但是宽度几乎不变，最终表现为长丝状。这种菌体的丝化现象被认为是细菌在应对外部环境应激时的自我保护机制之一[20]。

图3 不同pH值下酸土脂环酸芽孢杆菌菌体形态变化Fig.3 Morphological changes of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

2.3 DBD-等离子体对酸土脂环酸芽孢杆菌的杀灭作用分析

不同pH值条件下培养的菌体经离心、洗涤并重新分散于无菌生理盐水溶液和非浓缩苹果汁中，采用DBD-等离子体进行处理。处理后的酸土脂环酸芽孢杆菌梯度稀释并进行平板培养，进而分析DBD-等离子体对不同pH值生长的菌体的致死作用，结果如图4所示。从图中可以看出，在生理盐水（图4a和b）和苹果汁（图4c和d）中，DBD-等离子体对酸土脂环酸芽孢杆菌的灭活量均随着处理电压和时间的增加而增大，且对不同pH值生长下的酸土脂环酸芽孢杆菌杀灭效率表现出一定差异。例如当处理电压为20 kV，时间为1.0 min条件下，DBD-等离子体处理对pH值为3.2条件培养的酸土脂环酸芽孢杆菌杀灭效率为3.0个对数（图4a）。相比之下，DBD-等离子体对pH值为3.6条件下培养的菌体灭活数显著降低，仅为3.6个对数（P＜0.05），且pH值为4.0条件生长的酸土脂环酸芽孢杆菌的死亡数量最低，约为1.1个对数（P＜0.05）。当处理时间为2.0 min时，不同pH值培养下的酸土脂环酸芽孢杆菌灭活量都有一定的提高，但不同温度之间酸土脂环酸芽孢杆菌的灭活量仍有差异。其中DBD-等离子体处理引起pH值3.2条件培养的酸土脂环酸芽孢杆菌灭活量为4.7个对数，导致pH值为3.6和4.0培养的酸土脂环酸芽孢杆菌的失活量则分别为4.2和2.7个对数（P＜0.05）。当处理电压为30 kV，处理时间为2.0 min时（图4b），pH值3.2、3.6和4.0条件下培养的酸土脂环酸芽孢杆菌灭活量分别达5.9、5.4和4.8个对数。以苹果汁为处理体系也展现出类似的现象（图4c和d）。

pH值为3.2～4.0范围内，酸土脂环酸芽孢杆菌对等离子体的耐受性的高低可能与菌体形态直接相关。研究表明，DBD-等离子体处理时能够产生自由基如活性氮类和活性氧类物质[8,21]，对细菌表面产生强烈的刻蚀作用导致细胞膜的破裂，进而引起菌体死亡。因此菌体表面积越大，所遭受的自由基损伤越严重[22]。相比于最适pH值4.0，pH值3.2和3.6条件下培养的酸土脂环酸芽孢杆菌呈长杆状，表面积显著增加，由等离子引起的致死率显著增加。pH值3.2条件下培养的菌体长杆状数量更多、且长度相对更大，因而死亡率最高。

值得注意的是，DBD-等离子体对pH值为4.4条件下培养的酸土脂环酸芽孢杆菌形态正常，相比于pH值4.0生长的菌体表现出致死率更高的现象。该结果可能与菌体膜脂质存在一定关系。大量研究表明，环境的改变可介导细菌细胞膜脂肪酸组成进而影响其对热与非热灭菌技术如脉冲电场、等离子体和超高压等的耐受性[23,24]。例如，Wang等[12]研究发现金黄色葡萄球菌对脉冲电场的耐受性与细胞膜支链/直链脂肪酸含量有一定的联系，柚皮素介导的金黄色葡萄球菌为了增加细胞膜流动性，合成了更多的支链脂肪酸，进而更易被脉冲电场击穿。Pan等[24]研究了不同温度下李斯特菌对等离子体的耐受性，结果表明温度越低李斯特菌对等离子体的耐受性越强，认为主要与低温下李斯特菌细胞膜中的支链脂肪酸（Anteiso-C15:0）相对含量增加有关，这类脂肪酸与亲水性活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）相互作用，降低ROS渗入细胞内部的效率，提高了李斯特菌对等离子体对DBD-等离子体的耐受性。

2.4 不同pH值下的酸土脂环酸芽孢杆菌膜脂肪酸分析

为了验证酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜脂肪酸成分与其对等离子体耐受性之间的关系，不同pH值下培养至稳定期初期的酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜脂肪酸成分经提取，甲酯化和气质联用分析，结果如表1所示。所检测出的脂肪酸种类主要为7种，分别为肉豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、棕榈油酸、油酸、环己烷十一酸（ω-Cyclohexyl C17:0）和环戊烷十三酸（ω-Cyclopentane C18:0）。这些膜脂肪酸可以分为三类，即直链脂肪酸、不饱和脂肪酸和环状脂肪酸。从表中可以看出，在不同pH值条件下酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜中以上三类脂肪酸的总量没有太大变化（P＞0.05），但单一脂肪酸成分存在显著差异（P＜0.05）。其中环己烷-11-十一酸在培养pH值为3.2时相对含量最低，占35.49%。随着培养pH值的增加（3.2～4.4），环己烷-11-十一酸含量逐步增加，分别占48.37%、59.21%和67.86%（P＜0.05）。相比之下，环戊烷-13-十三酸的含量则出现下降的趋势，随着pH值的升高从53.83%降低至40.94%、31.61%和22.21%。研究表明，细菌处于不同环境下，为了维持一个合适的细胞膜流动性，会改变细胞膜中不同脂肪酸的含量[25,26]。其中直链脂肪酸可在细胞膜中排列整齐，堆叠性好而紧密。因此直链脂肪酸在细胞膜中所占比例越高，细胞膜的流动性越低[16]。相比之下，支链脂肪酸堆叠性差所占空间更大，因此更有利于增加细胞膜的流动性[24]。ω-环状脂肪酸是一类较为特殊的支链脂肪酸，主要出现在嗜酸耐热菌细胞膜中，且含量可达到60%～90%。本研究中，酸土脂环酸芽孢杆菌为嗜酸耐热菌，环己烷-11-十一酸和环戊烷-13-十三酸占比超过80%。研究表明，堆叠疏松的ω-脂环脂肪酸可通过形成动态屏障，限制脂质扩散和H+的跨膜扩散，从而保护嗜酸耐热菌的免受H+的毒害作用[27]。最近的研究表明，ω-环状脂肪酸在细胞膜中的堆积松散，引起脂质尾部的有序度降低进而导致细胞膜流动性增加，并且ω-脂环脂肪酸中的环尺寸越大，其作用越明显[28]。本研究中随着培养pH值的上升（3.2～4.4），酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜中环己烷-11-十一酸的相对含量逐步增加，从48.37%增加至67.86%（P＜0.05），而环戊烷-13-十三酸的含量从53.83%减少至22.21%。该结果表明，pH值的升高，酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜流动性逐步增加。由此可推断，在低pH值条件下，酸土脂环酸芽孢杆菌通过调整环己烷-11-十一酸与环戊烷-13-十三酸的相对比例降低细胞膜流动性，进而适应低pH值环境达到生长的目的。

表1 不同pH值培养下的酸土脂环酸芽孢杆菌的膜脂肪酸种类Table 1 Membrane fatty acid composition of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

与低酸（H+）作用机制不同，等离子体处理过程中会产生各类活性氧、活性氮成分如臭氧、羟基自由基、单线态氧自由基等会损害脂肪酸的功能，诱导脂质尤其是不饱和脂肪酸的过氧化，甚至破坏细胞膜导致细胞裂解而引起细菌死亡[29,30]。另外，等离子处理产生的自由基还能跨过细胞膜进入细胞质攻击核酸等生物大分子[31]。由此可以推断，环己烷-11-十一酸可能更有利于氧自由基等成分在细胞膜中的堆积，不仅引起细胞膜的破坏，还增加了氧自由基等成分的进入而引起细胞死亡。因此，相比于pH值4.0，pH值4.4条件下生长的菌体细胞膜中环己烷-11-十一酸含量的增加，是其对等离子体耐受性降低的潜在原因。

3 结论

本研究探讨了不同pH值生长条件对DBD-空气低温等离子体灭活酸土脂环酸芽孢杆菌的影响，结果表明不同pH值条件下生长的酸土脂环酸芽孢杆菌对DBD-空气低温等离子体的耐受性存在差异。其中pH值3.2条件下生长的菌体耐受性最低，pH值升高（3.2～4.0），菌体耐受性逐步增强，然而pH值4.4条件下生长的菌体对等离子体耐受性并未进一步增强，反而表现出降低的趋势。这种耐受性的差异主要与菌体形态和菌体膜脂质有关。扫描电镜结果表明，pH值3.2和3.6条件下生长的菌体呈现长杆状，使其表面积增大，因而菌体更易被自由基损伤而导致死亡。气相-质谱联用结果显示不同培养温度下酸土脂环酸芽孢杆菌细胞膜成分有一定的差异，且pH值的升高使细胞膜中环己烷-11-十一酸含量逐步升高，而环戊烷-13-十三酸则逐步降低。这种变化使pH值4.4培养下的酸土脂环酸芽孢杆菌耐受性降低更易被DBD-空气低温等离子体导致氧化损伤而死亡。