LncRNA CoroMarker在急性心肌梗死患者外周血单核细胞中的表达及意义

陈云宪，张文涛，梁家荣，涂少文，周锡文，陈志鑫，夏珏，唐良秋

ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是一种表现为相应心电图导联ST段抬高的急性冠脉闭塞性疾病，有较高的发病率和死亡率，常引起心源性死亡、慢性心力衰竭、心律失常等心脏并发症[1]。冠状动脉（冠脉）粥样硬化引起冠脉狭窄和斑块破裂导致急性血栓形成是STEMI的主要发病过程，而炎症反应则是贯穿整个发病过程的重要环节[2]。长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，越来越多研究证实许多不同类型的LncRNA在STEMI的发病中起着重要作用，包括调控心肌细胞凋亡、自噬、坏死、氧化应激、炎症等[3]。最近有学者发现[4]，冠心病患者的外周血单核细胞（PBMCs）和血浆中LncRNA OTTHUMT00000387022（CoroMarker）表达明显增加，其中LncRNA CoroMarker诊断冠心病的AUC高达0.940，是冠脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的一种新型特异性生物标志物。CoroMarker与炎症呈负相关的基因聚集在一起，可能起到调控炎症的作用。对于LncRNA CoroMarker是否在STEMI中也存在着生物学作用目前尚未见相关研究，本文通过分析STEMI患者PBMCs中CoroMarker和血浆细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达水平，阐述CoroMarker在STEMI中的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组连续选取2020年7月至2021年1月于广东省韶关市粤北人民医院心血管内科住院确诊为STEMI的患者30例作为研究对象（STEMI组），其中男性36例，女性14例，年龄43~72（60.03±8.69）岁。纳入标准：所有STEMI患者均符合中华医学会2019 年《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》诊断标准[5]，均行急诊冠脉介入手术，证实存在冠脉急性闭塞。排除标准：严重肝肾功能损害、重症感染性疾病、心力衰竭、严重的心脏瓣膜疾病、严重心律失常、恶性肿瘤、血液系统性疾病和自身免疫系统疾病。另选取本院体检中心同时期健康体检的无冠心病人群30例作为对照组，其中男性30例，女性20例，年龄40~67（56.77±7.68）岁。本研究经本院伦理委员会批准，经患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 收集一般临床资料、生化指标和预后资料收集所有研究对象一般临床资料，包括性别、年龄、血压、吸烟史、高血压史及糖尿病史等。收集血常规、血脂、电解质、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血肌酐（SCr）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、左室射血分数（EF）等检查指标。记录患者住院期间和出院后1年内主要不良心血管事件（MACE）发生情况，包括：心源性死亡；再发急性心肌梗死；心绞痛反复发作；恶性心律失常（如室性心动过速、心室颤动、严重的心动过缓）；支架内血栓形成；心源性休克；心力衰竭：包括急性心力衰竭或心功能评定为纽约心脏协会（NYHA）Ⅲ~Ⅳ级。

1.2.2 CoroMarker和MCP-1检测所有入选对象入院后即刻采集5 ml静脉血于EDTA抗凝管中，控温离心机4 ℃、3000 r/min离心血液样本10 min。吸取上层血浆样本至1.5 mL离心管中，保存于超低温冰箱（-80 ℃），待样本收集完毕后统一采用ELISA法检测血浆MCP-1水平。离心下层血液样本加入淋巴细胞分离液2.5 mL，以20 ℃、400 g的条件离心30 min，提取PBMCs。使用Trizol法提取RNA，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA完整性。按照反转录试剂盒说明书进行操作。qRTPCR法检测PBMCs中CoroMarker的表达情况。根据Genebank中CoroMarker序列，使用primer 6.0软件设计引物（表1）。

表1 实验用PCR 引物序列及扩增片段大小

1.3 统计学分析所有数据均采用SPSS 26.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，正态分布的计量资料两组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料两组间比较采用非参数检验Mann-Whitney U检验；计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。CoroMarker对STEMI的诊断价值采用受试者工作特征（ROC）曲线分析，对预后的影响采用多因素Cox回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较两组人群性别构成、年龄无统计学差异（P＞0.05），但高血压病、糖尿病、LDL-C、总胆固醇等心血管危险因素存在统计学差异（P＜0.05），表2。

表2 两组患者一般临床资料比较

2.2 两组患者外周血单核细胞CoroMarker和血浆MCP-1的表达水平LncRNA CoroMarker在STEMI组患者外周血单核细胞CoroMarker相对表达量为0.21±0.25，与对照组的相对表达量相比明显下降，差异有显著统计学差异（P＜0.01，图1A）。STEMI组患者的血浆MCP-1 浓度高于对照组[（173.06±9.76）pg/mL vs.（144.15±10.59）pg/mL，P=0.032，图1B]。Pearson相关性分析提示STEMI组CoroMarker的Ct值与血浆MCP-1浓度成正相关（r=0.568，P＜0.01），即外周血PBMCs中CoroMarker的表达水平与血浆MCP-1浓度成负相关性（图1C）。

图1 两组患者外周血单核细胞CoroMarker（A）和血浆MCP-1（B）的表达水平比较；MCP-1与CoroMarker相关性分布散点图（C）

2.3 CoroMarker作为STEMI诊断标志物的ROC分析ROC曲线分析显示LncRNA CoroMarker的AUC为0.806（95%CI：0.705~0.920，P＜0.001）。诊断STEMI的敏感度和特异性分别为75.0%、76.7%，cut-off值为CT值12.02（图2）。

图2 CoroMarker诊断STEMI的ROC曲线

2.4 CoroMarker与STEMI患者预后的相关性追踪患者住院期间及出院后1年主要不良心血管事件（MACE）发生情况，包括心源性死亡、心室颤动、室性心动过速、再发急性心肌梗死、反复心绞痛发作、心力衰竭、新发脑梗死。住院期间发生心源性死亡1例，心室颤动1例，室性心动过速1例，心力衰竭4例。出院后1年内，再发心绞痛发作5例，再发急性心肌梗死1例，新发脑梗死1例，心力衰竭5例，室性心动过速1例。多因素Cox回归分析发现CoroMarker是STEMI患者住院期间发生MACE事件的保护因子（HR=0.28，95%CI：0.08~0.96，P=0.042），但与STEMI患者出院1年内发生MACE事件无明显相关性（HR=0.78，95%CI：0.47~1.29，P=0.326），图3。

3 讨论

急性心肌梗死（AMI）是全球发病率和死亡率的主要原因之一，AMI实质上是一种心肌坏死和炎症反应的过程，炎症程度与缺血再灌注损伤、不良心脏重构、心肌梗死面积和预后不良有关。研究认为，促炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白介素-6（IL-6）和白介素-1（IL-1）以及脂肪因子脂联素等水平升高与高死亡率和发病率有关。相反，抗炎症细胞因子，如白介素-10（IL-10）、omentin-1等可抑制AMI诱导的炎症反应，与更好的预后相关[6]。促炎和抗炎细胞因子的失衡是改变AMI预后的重要因素，对于AMI炎症因子和相关信号通路的研究一直是心血管领域的研究热点。本研究发现，LncRNA CoroMarker是STEMI的一个重要生物标志物，可能通过调控相关炎性因子参与STEMI的发病过程。

许多LncRNA已被证实在AMI中起着重要的调控炎症和心肌凋亡的作用[7]。如LncRNA MIAT、MALAT1、MDRL等在AMI中上调表达，而ANRIL、HOTAIR、MDRL等表达水平下降，可通过调控不同的信号通路或自噬等，参与心肌坏死、氧化应激、炎症、线粒体功能调节和钙超载[3,8]。由于AMI患者的死亡率很高，早期发现和治疗可显著改善患者预后。LncRNA具有高度的组织特异性，也是存在于血浆、血清、尿液和其他体液样本中的相对稳定的二级结构。因此，LncRNA可作为诊断和预测多种疾病预后的新型生物标志物[9]。有研究发现，STEMI患者外周血中6个LncRNAs显着高于非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者，可用于鉴别STEMI和NSTEMI[10]。Cai等[4]发现，LncRNA CoroMarker是冠心病的最佳候选生物标志物，且独立于已知的冠心病危险因素和其他心血管疾病。功能富集分析表明，CoroMarker与炎症呈负相关的基因聚集在一起。本研究发现CoroMarker在STEMI中表达较非疾病人群明显下降，对诊断STEMI同样具有良好的价值，且CoroMarker与血浆MCP-1浓度具有显著负相关性。MCP-1是一种通过与CC趋化因子受体2（CCR2）结合来调节单核细胞趋化性和T淋巴细胞分化的趋化因子，在炎症性疾病、动脉粥样硬化和癌症的发病机制中起关键作用[11]。有学者对STEMI后的患者的单核细胞亚群进行了定量分析，发现循环中的非经典单核细胞与心肌坏死之间存在正相关[12]。我们猜测CoroMarker可能通过调节MCP-1及相关信号通路参与心肌炎症过程，但具体信号通路仍需进一步研究证实。

寻找良好的预后生物指标也是心血管领域的研究热点，个别LncRNA已被证实在AMI中具有一定的预后预测价值，如ANRIL、KCNQ1OT1和心肌梗死相关转录本可预测AMI后4个月是否会发生左心室心脏功能受损[13]。我们研究发现，CoroMarker可预测STEMI患者院内主要不良心血管事件的发生，是院内MACE的保护因子，但对出院后长期MACE无预测价值。这可能是因为AMI急性期的病理生理是影响短期预后的重要因素，而长期预后还受药物治疗、生活方式和其他心血管危险因素的控制情况影响。一些研究者通过细胞或动物模型的研究发现，上调或下调关键LncRNA的表达水平可能是治疗AMI的一种治疗策略。在大鼠AMI模型中，HOTAIR过表达可抑制炎症和心肌细胞凋亡，并减少心肌梗死面积[14]。对于CoroMarker能否作为一种治疗AMI的干预靶点，仍需深入研究。

本研究局限性在于：仅在STEMI患者血液循环PBMC中检测CoroMarker的表达水平，未在动物或细胞层面深入分析上下游信号通路，难以阐明CoroMarker的具体分子机制；样本量较少，且为单中心研究，需更大的样本量确保其作为生物标志物的诊断潜力。总之，我们在人体中初步证实LncRNA CoroMarker可作为STEMI的诊断生物标志物，具有预测STEMI患者住院期间发生主要不良心血管事件的作用，并且可能通过调控相关炎性因子参与STEMI的发病过程。后期有必要进一步深入分析CoroMarker的具体生物机制，为心肌梗死的治疗提供更多理论依据。