YAP、p-STAT3、LMP2A在鼻咽癌中的表达及临床意义

王赟 王芹 徐亮

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）在我国是最为常见的恶性肿瘤之一，其发生于鼻咽部黏膜上皮，临床症状多于中晚期较为明显，如涕中带血、听力下降、颈部淋巴结肿大等，而诱发NPC 患者死亡的原因则多由于远处转移或再次复发［1］。临床上多使用放射的手段治疗NPC，于早期NPC 患者而言，单纯使用放射治疗是可治愈的，但于中晚期患者来说，治疗后仍需面临着肿瘤转移或复发的风险［2］。近年来的研究发现，Yes 相关蛋白（Yes Associated Protein，YAP）是一种原癌基因，在多种肿瘤中呈异常表达［3］。磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated signal tranducers and activators of transcription，p-STAT3）高表达于多种恶性肿瘤中，其可能参与肿瘤的发生发展［4］。外源性表达潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A，LMP2A）可促进NPC 肿瘤干细胞的自我增殖，且其在控制细胞侵袭转移、凋亡、分化等方面发挥着重要的作用，是EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潜伏感染和维持上皮细胞转化的原因，而EBV 和上皮间质转化均在NPC 的发生发展中起着重要的作用［5］。对此，本次研究旨在探讨YAP、p-STAT3、LMP2A 在鼻咽癌中的表达及临床病理特征、预后的关系，旨在为临床治疗提供新思路，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020 年12 月至2021 年12 月于临沂市人民医院接受治疗的202 例NPC 患者的活检术石蜡标本作为观察组，同时收集本院98 例鼻咽黏膜慢性炎组织标本作为对照组。观察组男性165 例，女性37 例；平均年龄（51.47±4.28）岁，TNM 分期：Ⅰ期68 例，Ⅱ期52 例，Ⅲ期45 例，Ⅳ期37 例；对照组男性77 例，女性21 例；平均年龄（50.87±4.31）岁。两组患者的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属已签署知情同意书。

纳入标准：①临床资料完整者；②观察组符合《西班牙医学肿瘤学会鼻咽癌临床指南（2017）介绍》中NPC 相关诊断标准者［6］；③无其他恶性肿瘤者。排除标准：①合并其他感染性疾病者；②合并血液系统疾病者；③合并服用精神类药物病者。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

石蜡包埋，切成薄片（厚度为5 μm）放于载玻片上，放入培养箱中培养（37℃，12 h），结束后使用二甲苯进行脱蜡（2 次，10 min/次）。使用PBS 液进行漂洗（3 次，3 min/次），使用苏木素染色2 min，使用显微镜对YAP、p-STAT3、LMP2A 三种蛋白的表达情况进行观察和计数。已知阴性对照使用阴性组织切片、阳性对照使用阳性组织切片、空白对照为PBS 液代替一抗。

1.2.2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表达判定标准

YAP 阳性表达定位于胞核和胞质，p-STAT3阳性表达定位于胞质，LMP2A 阳性表达定位于胞质和胞膜。免疫组织化学染色法评判标准［7］：①按染色强度可分为：无着色、淡黄、棕黄以及棕褐，分值记为0～3 分；②按阳性细胞数占总细胞数的百分比可分为：5%以下、6%～25%、26%～50%、51%～75%、75%以上，分值记为0～4 分；③实验结果为①②所得分值相乘后的积：0 分为阴性表达（-），1～4 分为弱阳性表达（+），5～8 分为中度阳性表达（++），9～12 分为强阳性表达（+++），其中以（-）及（+）作为低表达，以（++）及（+++）作为高表达。

1.2.3 随访方法

自患者治疗结束后使用电话形式进行为期一年的随访，截止时间为2022 年12 月或至患者死亡。

1.3 观察指标

①比较两组YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白的高表达率。②分析YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白与观察组病理参数关系：主要包括性别、年龄、TNM 分期、病理分型、组织分化、远处转移、淋巴结转移和家族史等。③分析不同预后情况的一般资料及YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表达：根据随访情况分为预后良好组（无转移、复发）和预后不良组（病情发展、死亡）［8］，收集临床资料，主要包括性别、年龄、临床分期、淋巴结转移、YAP、p-STAT3 和LMP2A。

1.3.4 采用Logistic 回归模型分析影响NPC 患者预后相关因素。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表达比较

观察组YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白高表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白在不同组织中的表达（免疫组化染色，×400）Figure 1 Expression of YAP，p-STAT3 and LMP2A proteins in different tissues（immunohistochemical staining，×400）

表1 两组YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表达比较［n（%）］Table 1 Comparison of YAP，p-STAT3，LMP2A protein expression between the two groups［n（%）］

2.2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白与观察组病理参数关系

不同TNM 分期、组织分化以及有无远处转移NPC 患者之间YAP 表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）；不同TNM 分期和有无淋巴结、远处转移NPC 患者之间p-STAT3 表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）；不同TNM 分期、组织分化以及有无淋巴结转移NPC 患者之间LMP2A 表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白与观察组病理参数关系［n（%）］Table 2 Relationship between YAP，p-STAT3，LMP2A protein and pathological parameters of observation group［n（%）］

2.3 两组不同预后情况YAP、p-STAT3、LMP2A表达

经随访后发现，预后良好组181 例，预后不良组21 例；两组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同预后患者TNM 分期、淋巴结及远处转移情况、YAP、p-STAT3、LMP2A 高表达率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白与NPC 患者预后关系［n（%）］Table 3 Relationship between YAP，p-STAT3，LMP2A protein and prognosis of NPC patients［n（%）］

2.4 影响NPC 患者预后相关因素分析

经Logistic回归分析可知，TNM 分期为Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、远处转移、YAP、p-STAT3 及LMP2A 高表达是影响NPC 患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

表4 影响NPC 患者预后多因素分析Table 4 Multivariate analysis of influencing the prognosis of NPC patients

3 讨论

NPC 发病率在我国华南地区耳鼻咽喉恶性肿瘤中高居首位，在临床上大部分患者发现自身患病时病情多已处于中晚期，有30%～40%的晚期患者有高复发和远处转移的风险，而NPC 侵袭转移是制约其放射、化学治疗疗效的主要原因［9］。

有研究显示［10］，LMP2A 对于维持肿瘤干细胞特性和调控细胞生理活动起着至关重要的作用。王莹等研究显示［11］，LMP2A 在NPC 组织中表达高于对照组，且LMP2A 低表达患者的平均生存时间长于高表达组。本次实验中，LMP2A 蛋白在NPC组织中的高表达率高于对照组，且Ⅲ+Ⅳ期、中低分化及淋巴结转移NPC 患者LMP2A 蛋白高表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化及无淋巴结转移患者，提示LMP2A 蛋白可能参与NPC 的病情进展。分析机制为：LMP2A 可以参与Wnt/ β-cate-nin、PI3K/Akt、MAPK、ERK 和Hedge-hogn 等多条信号通路的调控，且对于细胞一系列生理活动以及维持肿瘤干细胞特性具有调控作用。

有研究表明［12］，肿瘤的发生与YAP 过量表达关系密切，YAP 在调控细胞的凋亡和发育生长过程中起着重要的作用。有关文献报道［13］，YAP 的过量表达会促进肿瘤细胞的增殖与生长，且速度与其表达呈正相关。本实验中，YAP 蛋白在NPC组织中的高表达率高于对照组，且YAP 蛋白与NPC 患者不同TNM 分期、组织分化以及有无淋巴结、远处转移等因素之间存在显著联系，与上述研究结果相似，提示YAP 蛋白与NPC 疾病的进展有着密切联系。

p-STAT3 是STAT3 的磷酸化，且p-STAT3 是信号传导通路持续激活的形式，异常激活的STAT3 信号通路在肿瘤的发展、发生和细胞增殖的调控中发挥着重要的作用，与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系［14］。车祺等［15］研究发现，p-STAT3 通路的激活是子宫内膜肿瘤发展的重要因素，进一步数据分析显示：子宫内膜癌p-STAT3阳性表达率显著高于健康对照组，提示p-STAT3可能通过STAT3 信号通路参与促进肿瘤细胞的发生发展。本次研究中，p-STAT3 在NPC 组织中的高表达率高于对照组，且p-STAT3 蛋白与NPC 患者不同TNM 分期、组织分化以及有无淋巴结、远处转移等因素之间存在显著联系，与上述研究结果相似，说明p-STAT3 在NPC 的进展恶化中发挥着重要作用。

进一步研究显示：预后不良组的YAP、p-STAT3 以及LMP2A 高表达率明显高于预后良好组，三者与淋巴结转移和远处转移均是影响NPC 患者预后不良的独立危险因素，提示三者对NPC 患者的预后有重要的参考价值，可作为临床评估患者预后的有效指标。在NPC 患者的治疗中，应对伴有高危因素NPC 患者进行针对性干预，以有效缓解患者的病情进展，改善其预后。

综上所述，NPC 患者中YAP、p-STAT3、LMP2A 呈上升表达，且三者高表达与NPC 病情的发生发展以及预后之间存在密切联系，对预测患者预后不良具有重要意义。