2022 年辽宁省兽医系统实验室检测能力比对

杨洺扬，兰德松，顾贵波，赵 培，周 维，孙世宇

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110164）

自2010 年我国实施兽医系统实验室（简称兽医实验室）考核制度以来，实验室检测能力比对已成为提升实验室管理水平的重要抓手和评估实验室检测能力的主要手段[1-8]。为全面了解辽宁省市级和县级兽医实验室的检测能力及其动物疫病监测预警水平，推进兽医实验室体系能力建设，2022 年7 月，辽宁省农业发展服务中心动物疫病预防控制中心（以下简称“辽宁省疫控中心”）组织开展了2022 年全省兽医实验室检测能力比对工作[9]。全省13 个市级和57 个县级兽医实验室参加并完成了比对工作。本次能力比对客观反映出现阶段辽宁省市级和县级兽医实验室的检测能力水平以及存在的不足，为各级兽医主管部门制定针对性政策措施，重视并加大兽医实验室软硬件建设投入，进一步完善兽医实验室管理体系，提高实验室检测能力水平，提升动物疫情监测预警能力提供了依据。

1 材料和方法

1.1 比对项目设置

根据市级和县级兽医实验室检测能力和授权检测参数的不同，13 个市级和26 个具备分子生物学检测室的县级兽医实验室参加非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸检测、禽流感病毒（AIV）核酸检测（通用型）、猪O 型口蹄疫病毒（FMDV）抗体检测和H5 亚型AIV 抗体检测等4 个比对项目；其他31 个仅具备血清学检测能力的县级兽医实验室参加猪O 型FMDV 抗体检测、H5 亚型AIV 抗体检测、布鲁氏菌抗体检测和猪瘟病毒（CSFV）抗体检测等4个比对项目。所有项目均设置6份盲样。

1.2 检测试剂、试验方法和标准

针对6 个检测能力比对项目，采用相应国家标准中规定的检测方法。检测试剂由辽宁省疫控中心统一招标采购提供，核酸提取试剂由各市县实验室自行准备（表1）。

表1 比对项目的检测方法、依据标准和主要试剂

1.3 比对样品

各比对项目的比对样品由辽宁省疫控中心统一招标采购提供，并由辽宁省疫控中心实验室完成标定、分装、编号、保存和发放，将各项目比对样品随机组合成1 组6 份盲样。

1.3.1 ASFV 核酸荧光PCR 比对样品 参考Ct值为22.42、23.38、25.44、27.71、29.92 的标准样品以及阴性核酸标准样品，每组盲样至少包含1 个强阳（22.42）、1 个弱阳（27.71）、1 个阴性样品。

1.3.2 AIV 核酸（通用型）荧光RT-PCR 比对样品 参考Ct 值为22.92、26.05、29.12、30.96 的标准品以及阴性核酸标准样品，各参考值样品数量不确定。

1.3.3 H5 亚型（Re-13）AIV 抗体HA-HI 试验比对样品 参考值为0 log2、3 log2、4 log2、5 log2和7 log2 的禽血清样品，各参考值样品数量不确定。

1.3.4 O 型FMDV 抗体阻断ELISA 比对样品参考值为1:720、1:360、1:180、1:45、1:22.5 和＜1:8的猪血清样品，每组至少包含2 个参考值同为1:360的双份重复样品。

1.3.5 布鲁氏菌抗体竞争ELISA 比对样品 参考值为阳性、弱阳性和阴性的羊血清样品，阳性、弱阳性、阴性样品数量不确定。

1.3.6 CSFV 抗体间接ELISA 比对样品 参考值为阳性、弱阳性和阴性的猪血清样品，阳性、弱阳性、阴性样品数量不确定。

1.4 样品传递

为保证比对样品良好的生物学活性，样品须存放于-20 ℃冰箱中，分发样品时各市级兽医实验室派专人到辽宁省疫控中心领取市本级及其所辖县区兽医实验室的比对盲样及检测试剂，全过程冷藏运送，并于12 h 内送达各参加比对的兽医实验室。各实验室必须在收到比对盲样后48 h 内完成比对检测及结果上报。

1.5 结果判定标准

ASFV 核酸检测、AIV 核酸检测（通用型）、布鲁氏菌抗体检测和CSFV 抗体检测等4 个比对项目检测结果与标定值一致，即参考值为阳性（含弱阳）的盲样检测结果为“阳性”，参考值为阴性的盲样检测结果为“阴性”，判为比对结果准确；检测结果与参考值不一致，判为比对结果不正确。

H5 亚型AIV 抗体检测和O 型FMDV 抗体检测等2 个比对项目检测结果与标定值一致或存在1个滴度以内的偏离，判为比对结果准确；比对项目检测结果与标定值存在2 个及以上滴度的偏离，判为比对结果不正确。

1.6 结果分析

根据各比对项目的结果判定标准对各实验室检测结果进行判定，并进一步对ASFV 核酸荧光PCR 检测项目的定量值做偏离程度分析，按照CNAS-GL002《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[10]中方法进行能力统计量计算，以相对偏差（百分相对差D）和Z比分数，分析各实验室荧光Ct 检测值和参考值的差异。计算公式：D=（检测值-参考值）×100/参考值；Z=（检测值-参考值）/σ，其中σ表示能力评定标准差，根据经验值（预期值）设定为0.2×参考值[8，10]。本次比对试验中，强阳性样品Ct 参考值为22.42，弱阳性样品Ct 参考值为27.71。结果分析：|Z|≤2，表明“满意”；2 ＜|Z|＜3，表明“有问题”，产生警戒信号，提醒实验室应引起注意；|Z|≥3，表明“不满意”，实验室应分析原因，制定针对性整改措施[8，10-11]。

对O 型FMDV 抗体阻断ELISA 检测项目的双份重复样品检测结果做自身重复性分析。当实验室双份重复样品检测值一致，表明“满意”；当实验室双份重复样品检测值不一致，表明“不满意”，实验室应分析原因，制定针对性整改措施。

2 比对结果

2.1 总体情况

2022 年辽宁省共70 家兽医实验室参加全省兽医实验室比对，所有参比实验室均在限定时间内完成了检测比对及结果上报，其中53 家（市级13 家、县级40 家）比对结果全部正确，占75.71%，其余17 家出现错误的实验室中，1 家实验室出现4 份样品检测错误，3 家出现2 份样品检测错误，13 家出现1 份样品检测错误；检测比对样品共计1 680 份，其中23 份样品检测结果错误，其他样品检测结果均正确，样品检测结果准确率为98.63%（表2）。

表2 2022 年辽宁省兽医实验室检测能力比对总体情况

2.2 各比对项目情况

ASFV核酸检测项目共39家实验室参加比对，其中1 家实验室的1 份样品检测结果出现错误；AIV 核酸检测（通用型）项目共39 家实验室参加比对，其中3 家实验室的3 份样品检测结果出现错误；H5 亚型AIV 抗体检测项目共70 家实验室参加比对，其中5 家实验室的8 份样品检测结果出现错误；O 型FMDV 抗体检测项目共70 家实验室参加比对，其中9 家实验室的10 份样品检测结果出现错误；布鲁氏菌抗体检测项目共31 家实验室参加比对，其中1 家实验室的1 份样品检测结果错误；CSFV 抗体检测项目共31 家实验室参加比对，所有实验室检测结果全部正确（表3）。

表3 2022 年辽宁省兽医实验室各项目检测能力比对结果

2.3 ASFV 核酸荧光PCR 比对

39 家参加ASFV 核酸检测项目的实验室中，38 家实验室比对结果全部正确，只有1 家实验室的1 份样品结果出现错误。对所有实验室检测结果Ct 值进行差异分析发现，实验室间Ct 值差异较大，利用公式进行计算，各实验室比对结果Ct 值的Z比分数和Z比分数分布情况见图1。结果显示：|Z|≥3 的实验室共9 个，表明为“不满意”结果，占23.08%；2 ＜|Z| ＜3 的实验室共7 个，表明为“有问题”结果，占17.95%；|Z|≤2 的实验室共23 个，表明为“满意”结果，占58.97%。

图1 ASFV 核酸PCR 比对结果Z 比分数柱状图

2.4 O 型FMDV 抗体阻断ELISA 比对

70 家参加O 型FMDV 抗体检测项目的实验室中，9 家实验室的10 份样品结果出现错误。对所有实验室参考值同为1:360 的双份重复样品检测值进行实验室自身重复性分析发现：全部重复样品定性检测结果均正确，51 家实验室双份重复样品检测值一致，表明为“满意”结果；19 家实验室双份重复样品检测结果不一致，表明为“不满意”结果（图2）。结果表明，大部分实验室（51/70）检测结果自身重复性良好，实验室随机误差较小，但部分实验室在质控体系方面[12]存在问题。

图2 O 型FMDV 抗体阻断ELISA 双份重复样品检测值分布

3 讨论

从2022 年能力验证比对的总体结果来看，17个县级实验室在5 个检测项目的23 份样品中检测结果出现较大偏差，实验室总体正确率和样品正确率分别为75.71%和98.63%。从近3 年的全省兽医实验室能力比对结果来看，2022 年检测结果准确率较前两年小幅上升，2022 年较2020 年和2021年出现检测结果错误的实验室分别减少了7 个和18 个，样品检测结果准确率分别上升了0.1 和3.8百分点[13]，表明各地在机构改革后兽医实验室面临人员缩减、职能弱化等不利局面下，通过积极推进实验室资质认定，大力开展实验室技能培训，持续改进实验室管理体系等措施[8]，有效提升了实验室管理水平和检测能力。但2022 年仍有17 家实验室检测结果出现错误，4 家实验室有2 份及以上样品检测结果出现错误，7 家实验室连续2 年检测结果出现错误，表明部分县级兽医实验室检测能力有待提高，亟需采取针对性措施提升实验室检测能力和管理水平。建议各级兽医主管部门持续加强兽医实验室体系建设，给予现阶段能力薄弱的县级实验室一定的政策支持，保证实验室的人员能力、设施设备和试剂耗材等均能够满足实验室疫病参数检测需求。

本研究除对全部能力比对项目进行定性结果判定统计分析外，还对ASFV 核酸荧光PCR 项目和O 型FMDV 抗体阻断ELISA 项目的结果值分别进行了离散度和自身重复性分析，经Ct 值离散度分析发现9 家实验室项目能力为“不满意”水平，经自身重复性分析发现19 家实验室项目能力为“不满意”水平，表明以上实验室在实验室质控方面仍存在问题，建议出现问题的实验室从“人、机、料、法、环、测”等多角度查找问题，全面加强实验室内部质量控制。

本次能力比对共设置6 个检测项目，其中错误率占比较高的项目为O 型FMDV 抗体检测和H5 亚型AIV 抗体检测项目，分析原因可能与液相阻断ELISA 试验操作复杂，试验参数（环境和时间）控制不精确、HA-HI 试验4 单位抗原配置和回滴不准确、结果判定经验欠缺等因素有关。部分实验室检测值离散度较大和自身重复性差，分析原因可能与其使用的检测试剂批次内重复性差、检测仪器设备性能不稳定、加样量控制不精确等因素有关。进一步调查发现，出现结果偏离的实验室普遍存在实验室专业人才不足、人员年龄偏大、仪器设备老化、能力提升渠道不畅等不利因素。建议各级兽医实验室加大实验室建设和改造方面的资金投入力度，及时补充年轻的实验室人才，强化人员能力培训，进一步提升实验室管理者的质量管理水平和检测人员检测能力。

本次能力验证比对试验方案设计上存在一定的局限性：一是在病毒核酸荧光PCR 检测项目上应指定使用同种类核酸提取方式及提取试剂盒，以保证病毒核酸提取效率的一致性[8]；二是当前可获取的标准物质仅有ASFV 核酸标准物质，其他比对项目的比对样品均为标准样品，达不到标准物质的均一、稳定等特质，导致各实验室间分配的比对样品存在差异，从而影响检测结果的一致性。