河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株调查与耐药性分析

杜 娟，刘亚辉，苏玉贤

（1.开封市畜牧工作站，河南开封 475000；2.平顶山市畜牧发展中心，河南平顶山 467000）

副猪嗜血杆菌病也称为格拉瑟病（Glasser's disease），是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的猪细菌性传染病，以关节炎、心包炎、多发性浆膜炎、脑膜炎和败血症为病理特征，临床表现为体温升高、呼吸困难、咳嗽、跛行、神经失调等多种症状。HPS 是条件致病菌，通常定殖于上呼吸道，很少单独引起发病，在猪体发生免疫抑制或环境应激反应导致免疫力下降时，可与猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌等病原体发生混合感染，加重病情。HPS 在我国猪群中普遍存在，主要侵害4～8 周龄仔猪，引起的发病率为10%～15%，病死率可达50%以上[1]，给养猪业造成严重经济损失。

HPS 血清型较多，按照Kieleein-Rapp-Gabriedson（KRG）琼脂扩散方法分类至少有15 种，有约20%的菌株未能定型[2]。HPS 有明显的区域性和时期性特征，不同时期、不同地区甚至同一个养殖场可能存在不同血清型菌株流行，且不同血清型菌株间致病力差异大，缺乏完全交叉免疫保护或者交叉免疫保护率低[3-4]。尽管疫苗接种是有效防控HPS 感染的主要手段，但是HPS 商品疫苗仅有2～3 种血清型，疫苗株与流行的致病菌株血清型难以匹配，因而免疫保护作用有限[5]。目前，临床上使用抗生素是防治细菌性疫病不可或缺的重要措施。但是，HPS 易产生耐药性，长期滥用抗生素导致HPS 耐药性增强和新耐药菌株不断出现，给防治该病带来很大困难。因此，分离鉴定地方菌株，了解本地区HPS 流行菌株特点和开展耐药性监测可以提高疫苗免疫效果，减少药物盲目使用，对有效防控该病流行具有指导意义。本研究于2022 年从河南省安阳市25 家猪场采集临床疑似HPS 感染病死猪的肺脏、肝脏、心血等病料进行HPS 分离鉴定，并进行血清型分型、耐药性检测，以了解该地区猪场HPS 流行菌株血清型和耐药情况，为今后疫苗研制和临床药物筛选提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2022 年1—12 月在河南省安阳市不同区域选择25 家养猪场，无菌采集68 头临床疑似感染HPS病死仔猪和保育猪的肺脏、心血、关节液、脑、肝脏等组织病料，共175 份，其中肺脏47 份、脑组织44 份、肝脏18 份、心血19 份、关节液18 份、气管29 份，每个采集部位计为1 份病料。病猪死前主要表现为发热、咳嗽、关节肿大、站立不稳、皮肤黏膜发绀，剖检可见关节炎、腹膜炎、肺炎和心包炎等病变。25 家猪场病料采集信息见表1。

表1 25 家猪场病料采集信息统计

1.2 主要试剂、菌株及试验小鼠

胰蛋白大豆肉汤（TSB）、胰蛋白大豆琼脂（TSA）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、5%绵羊鲜血琼脂平板、犊牛血清，购自青岛海博有限公司；细菌基因组 DNA 小量抽提试剂盒（离心柱式），购自上海碧云天生物有限公司；胸膜肺炎放线杆菌（ATCC27090）质控菌株、16 种细菌药敏纸片、微量生化鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司；ATCC25923 金黄色葡萄球菌、HPS 1～15 型单因子标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所；DL 2000 DNA Marker、2×TaqMaster Mix、PCR试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒等，均购自天根生化科技（北京）有限公司；BALB/c 小鼠，购自浙江中医药大学动物实验研究中心。

图1 分离菌菌落培养和镜检结果

1.3 病原菌分离培养

用接种环无菌挑取病料分别接种于TSA 培养基（含有犊牛血清和0.01% NAD），37 ℃培养24～36 h 后，挑取形态为光滑湿润、无色透明、针尖大小的疑似HPS 菌落，再接种于TSA 培养基进行连续传代纯化培养；挑取疑似HPS 菌落制作细菌涂片，革兰氏染色、镜检，观察细菌形态和染色；挑取上述纯化培养菌落分别划线接种于含犊牛血清、未含NAD 的TSA 培养基，未含犊牛血清、NAD 的TSA 培养基，置恒温箱37 ℃培养24～36 h，观察菌落形态和生长情况。

1.4 病原菌“卫星生长”试验

挑取纯化培养的疑似HPS 菌落水平划线接种于5%绵羊鲜血琼脂平板，再垂直于上述水平划线接种金黄色葡萄球菌，于5% CO2培养箱，37 ℃培养24～36 h，观察是否有“卫星生长”（即待检菌落在靠近金黄色葡萄球菌处较多，越远菌落越少，直至不能生长[6]）和细菌溶血现象。

1.5 生化试验鉴定

挑取纯化培养的疑似HPS 菌落，分别接种于添加有2% NAD 和5%胎牛血清的葡萄糖、果糖、H2S 等微量生化鉴定试剂管，在5% CO2培养箱中37 ℃培养24～36 h 后进行接触酶、氧化酶试验，按照说明书进行操作并观察试验结果。

1.6 PCR 扩增鉴定

参考Oliveira 等[7]报道的方法设计合成HPS 16S rRNA 基因（GenBank 登录号M75065）特异性扩增引物（上游引物HPS-F：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物HPS-R：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'）。引物由深圳华大基因科技有限公司合成，预期扩增片段大小为821 bp。挑取TSA 培养基（添加有2%NAD 和5%犊牛血清）上的菌落，按照说明书利用基因组DNA 抽提试剂盒提取菌株DNA，以提取纯化的DNA 为模板用于PCR 扩增。PCR 反应体系（25.0 μL）：细菌DNA 模板 2.0 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，加入灭菌超纯水至25.0 μL。PCR 反应参数：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 min，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共运行30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 扩增产物利用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在自动紫外凝胶成像仪下观察拍照，记录结果，同时设阴、阳性对照。扩增产物克隆、纯化后，送深圳华大基因科技有限公司测序，用BLAST 软件对测得的基因序列与GenBank 中公布的HPS 16S rRNA 序列进行同源性比对分析。

图2 部分分离菌株16S rRNA PCR 扩增电泳结果

1.7 分离菌株血清分型

采用文献[8]中的免疫琼脂扩散试验方法进行分离菌株血清型鉴定。

1.7.1 分离菌株分型抗原制备 取分离菌株接种于TSA 培养基，37 ℃培养24～36 h，再挑取菌落接种于TSA 培养基对分离菌进行复壮培养。用PBS（pH 7.2）缓冲液洗脱菌苔，将其装入离心管中，12 000 r/min 离心2～3 min；弃掉上清液，加入9 倍于沉淀物体积的PBS（pH 7.2）缓冲液，混匀，121 ℃高压处理1～2 h，12 000 r/min 离心2～3 min；收取上清液，即为分离菌株血清学分型抗原。

1.7.2 血清分型琼脂扩散试验 分别称取0.85 g NaCL、1.00 g 琼脂糖，加入PBS（pH 7.2）缓冲液100 mL，混匀加热溶解，制成厚度约4 mm 的琼脂平板，倒置于冰箱，4 ℃保存备用。用打孔器在平板中央和周围根据需要打出孔间距3 mm、孔直径4 mm 的圆孔，火焰封底。中央孔添加分离菌株分型抗原，周围孔添加HPS 1～15 型单因子标准阳性血清，37 ℃条件下，在湿盒中作用24～36 h，观察判断试验结果。如果抗体孔与抗原孔之间出现清晰的白色沉淀线，则判分离菌为对应的阳性血清型菌株，反之判为阴性菌株。

1.8 耐药性试验

对34 株分离菌采用K-B 纸片法进行药敏检测。将分离菌株接种于含有0.01% NAD、5%犊牛血清的TSB 液体培养基，37 ℃培养12～24 h后，接种于生理盐水，漩涡混匀，调整菌液浓度至0.5 麦氏浊度，用灭菌棉签蘸取菌液，均匀涂布于含有0.01% NAD、5%犊牛血清的TSA 培养基上；用无菌镊子分别夹取16 种细菌药敏纸片均匀平贴于TSA 培养基上面，在5% CO2、37 ℃条件下培养24～36 h，测定每种药敏纸片抑菌环直径大小。由于美国临床和实验室标准系会（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）中尚无HPS药物敏感性测定的标准方法，而胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）与HPS 均为引起猪呼吸道病的病原菌，且亲缘性较近，本次药敏试验采用CLSI（2015 版）规定的胸膜肺炎放线杆菌药敏测定方法，以胸膜肺炎放线杆菌（ATCC27090）为质控菌株，按照CLSI（2015 版）标准判读药敏试验结果[9]，判定标准见表2。

表2 药物敏感性判断标准 单位：mm

2 结果

2.1 病原菌分离培养

培养36 h 后观察培养基上菌落形态和生长情况，可见在TSA 培养基（含有犊牛血清和0.01%NAD）上产生针尖大小（直径0.5～2 mm）、无色透明、光滑湿润的菌落，而在添加犊牛血清、未添加NAD 的TSA 培养基和未添加犊牛血清和NAD的TSA 培养基上均无上述菌落生长。对单个菌落革兰氏染色镜检，可见菌体为革兰氏阴性菌，且呈细丝状、长杆状和球杆状等不同形态。将34 株疑似HPS 菌落和金黄色葡萄球菌接种在5%绵羊鲜血平板上，均可见靠近金黄色葡萄球菌划线两侧出现明显的“卫星生长”现象，而远离划线处菌落稀少或无菌落生长，且菌落不溶血。共从175 份病料中分离培养出34 株疑似HPS。菌落培养和镜检结果见图1。

2.2 生化试验

利用微量生化反应鉴定管对34 株分离菌进行生化试验。结果显示：所有分离菌株发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖生化反应均为阳性，而对木糖、乳糖、甘露醇生化反应结果不一致；对脲酶、H2S、吲哚、赖氨酸、苯丙氨酸、氧化酶生化反应均为阴性，氧化酶、接触酶试验均为阳性。34 株分离菌株生化特性均符合标准HPS 的生化特性。生化试验结果见表3。

表3 34 株分离菌生化试验结果

2.3 分离菌PCR 鉴定

以分离株DNA 为模板，利用HPS 的16S rRNA 基因特异性引物进行PCR 扩增，将产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR 鉴定结果显示：对所有分离菌株16S rRNA 基因PCR 扩增，均获得大小为821 bp 的目的条带，与预期目的条带相吻合。经BLSA 比对，测得序列与GenBank 中公布的HPS 16S rRNA 序列同源性在97%以上。结合分离菌株分离培养、镜检、生化特性试验及PCR鉴定结果，综合判定34 株分离菌株均为HPS，检出率为19.43%（34/175）。PCR 电泳检测结果见图2。

2.4 血清学分型鉴定

采用免疫琼脂扩散方法，对34 株HPS 分离菌株进行血清学分型鉴定试验。结果显示：分离率最高的是血清4 型14 株，占41.18%；血清5 型4 株，占11.76%；血清6 型3 株，占8.82%；血清13 型8 株，占23.53%；未定血清型5 株，占14.71%。分型菌株占菌株总数的85.29%。结果表明，河南省安阳市存在HPS 血清4、5、6 和13 型流行，其中血清4 型为优势血清型。25 家猪场分离菌株数量及血清型分布情况见表4。

表4 25 家猪场分离菌株数量及血清型分布情况

2.5 耐药性检测

采用K-B 纸片法对临床分离鉴定的34 株HPS进行药敏试验，并根据CLSI M100—S25 标准判断。结果（表5～6）显示：分离的HPS 菌株对16 种抗生素的耐药性差异较大。对阿莫西林、青霉素G、链霉素、土霉素4 种抗生素耐药性最高，耐药率为88.24%～94.12%；对林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、大观霉素、阿奇霉素等7 种抗生素耐药性相对较低，耐药率为47.06%～73.53%；对头孢噻呋、头孢氨苄、诺氟沙星、环丙沙星、替米考星5 种抗生素耐药性最低，耐药率为8.82%～20.59%。34 株HPS分离菌株多重耐药性较严重，对5 种以上抗生素产生了耐药性，最多的为12 种。其中，耐9 种抗生素菌株最多，占菌株总数的29.41%。结果表明，河南省安阳市流行的HPS 菌株耐药性较严重。

表5 34 株HPS 分离株耐药性检测结果

表6 HPS 分离株多重耐药检测结果

不同血清型中，除血清4 型对头孢氨苄，5 型对头孢氨苄、诺氟沙星、环丙沙星，6 型对头孢噻呋、林可霉素，13 型对头孢噻呋、环丙沙星，未定型对替米考星没有产生耐药性外，分离的4 种HPS血清型菌株对多种抗生素存在不同程度的耐药性，其中血清4 型不但耐药菌株数最多，对15 种抗生素的耐药性也较高（表7）。

表7 不同血清型HPS 菌株对16 抗生素的耐药性检测结果 单位：%

3 讨论

本研究收集河南省安阳市25 家养猪场疑似感染HPS 病死猪的肺脏、心血等175 份组织病料，通过细菌分离培养、菌落形态观察、生化试验、PCR 鉴定等方法，分离出34 株HPS，检出率为19.43%。该结果低于王翠等[10]对豫北地区和王庆云[11]对河南省安阳市猪场HPS 鉴定的结果。HPS培养条件要求较高，分离难度大，病料样本数量、采集时间、部位和分离培养等因素都会影响调查结果，此外不同地区猪场的饲养环境和管理水平也与调查结果密切相关。本研究结果提示，河南省安阳市猪场存在一定程度的HPS 感染。因HPS 为条件致病菌，会在外部环境和饲养管理发生变化时导致感染猪群发病，且常与其他病原发生混合感染。因此，对于该病应开展常态化监测，加强综合防控，避免疫病暴发流行。

HPS 血清型较多，国内不同地区流行的血清型差异性较大，因此明确本地区HPS 血清型对本病防控具有非常重要意义。张青娴等[12]报道，2017—2018 年在河南省46 株HPS 菌株中，共检测出7 种血清型（2、4、5/12、6、7、11、13），其中血清型5/12 和4 型为优势血清型；李新果等[4]从2017—2018 年采自河南省不同地区的45份疑似病料中，分离鉴定出12 株HPS，血清型包括1、2、4、5、7、13 型；徐引弟等[13]报道，河南省流行的主要血清型包括4、5、7、13 型；郭龙等[14]2017 年对全国20 个省市疑似HPS 感染的样品进行细菌分离培养、PCR 鉴定分型，发现我国规模化猪场中主要流行的血清型为4、5/12 和14 型。本研究结果显示，河南省安阳市流行的HPS 血清型为4、5、6 和13，其中血清4 型为优势血清型，与上述学者报道基本一致。此外，本研究发现，在25 家猪场中有9 家猪场分离出2 种血清型HPS 菌株，其中4 家猪场的菌株来自不同的病料组织。从175 份病料组织的HPS 分离菌株数量看，有20 株来自肺脏，占比最高，分离率为42.55%（20/47），其次是关节液16.67%（3/18）、心血15.79%（3/19）、气管10.34%（3/29）、脑9.09%（4/44）、肝脏5.56%（1/18）。该结果与丁文文等[15]研究报道的发病猪不同组织器官分离的HPS 结果基本一致。本研究结果表明，HPS 最易导致呼吸系统感染，主要存在肺部，也可以进入血液循环系统造成全身性感染。不同血清型HPS 菌株的致病性也不同，其中血清1、5、10、12、13、14 型为高毒力菌株，2、4、5 型为中等毒力菌株，其他血清型为无毒力[16]。本研究表明，该地区流行的血清型较多，至少4 种，且主要为中等毒力和高毒力菌株。

养殖业滥用抗生素对HPS 形成持续的药物选择压力，造成其耐药性逐渐增强，多重耐药现象严重。通过分离菌耐药性检测了解猪场HPS 对常见抗生素的耐药情况，可以为临床用药提供指导。本研究采用K-B 纸片法进行34 株HPS 对16 种抗生素耐药性试验发现：分离菌株对阿莫西林、青霉素G、链霉素、土霉素耐药性4 种抗生素耐药率较高；多重耐药性比较严重，介于5～12 种，耐9 种抗生素菌株最多，占菌株总数的29.41%。与其他学者对HPS 耐药性研究报道的结果[17]有所不同，这是因为细菌耐药性形成机制复杂，菌株耐药性与耐药基因携带、传播，以及细菌结构特性、地区环境及抗生素使用等诸多因素密切相关。

HPS 感染是猪场常见的呼吸道疫病，流行于世界各地养猪场，也是危害我国养猪业的典型细菌性疫病之一，且随着猪场规模化不断发展，呈现地方流行性散发态势。HPS 是存在于正常健康猪群体内上呼吸道的共生菌和条件菌，如果猪体发生免疫抑制，导致免疫力下降，就会出现临床症状，也可引起全身性感染，在肺部、肝脏、关节渗出液等部位能检测出HPS。HPS 常作为继发性病原菌，在感染圆环病毒2 型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、流感病毒和伪狂犬病病毒等病原后导致猪群发病，也通常与巴氏杆菌、放线杆菌和链球菌等混合感染猪群，使猪病情复杂，诊断和防治难度增大。因此，病原的分离鉴定、敏感药物筛选是控制本病的重要前提。同时，要强化猪群日常管理，尤其是断奶猪和保育猪，应给猪群提供良好的饲养环境和营养均衡的日粮，提高猪体免疫力；积极实施疫苗免疫接种，尽量保持疫苗株和流行株一致。临床治疗用药要结合药敏检测分析结果，筛选敏感性药物，轮换交替用药，以减少HPS 耐药性。

4 结论

本研究发现：河南省安阳市猪场存在一定程度的HPS 流行；流行菌株血清型主要为4、5、6和13 型，其中血清4 型为优势血清型；流行菌株存在较高的耐药性，且多重耐药较严重。因此，当地应加强对HPS 感染的综合防治，合理使用抗生素。