鞘内注射siRNA-P300抑制CaMK Ⅱ磷酸化缓解佐剂性关节炎大鼠疼痛与炎症的作用机制

谈俊 高巍巍 滕志鹏 王广 代震宇 李炜

关节炎导致慢性疼痛甚至致残,对人们的生活造成严重负担[1]。关节炎的特征是疼痛、关节肿胀、畸形和功能丧失[2]。但不明确炎性疼痛的发生机制,本研究利用完全弗氏佐剂(CFA)诱导炎性疼痛模型[3],探讨关节炎性疼痛的机制。P300蛋白是组蛋白乙酰转移酶(HAT)家族的关键成员,在真核生物中参与基因表达的调控。研究表明,慢性压迫损伤(CCI)引起的神经性疼痛中P300激活增加[4],并依赖于钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的磷酸化[5]。研究表明,细胞内Ca2+相关级联反应引起的受体损伤和敏化可能是神经性疼痛的神经生理机制[6],其中CaMK Ⅱ的表达变化在其中扮演重要作用[7,8]。CaMK Ⅱ参与外周和中枢敏化过程[6,9]。还有研究表明,抑制CaMK Ⅱ可以改善CCI模型动物的疼痛敏化[6]。但是目前仍无关于P300与其依赖的CaMK Ⅱ的磷酸化调节方式在关节炎性痛模型中扮演的角色。本文假设P300通过抑制磷酸化的CaMK Ⅱ可能与关节炎性疼痛和抗炎作用有关。因此,本研究构建CFA诱导关节炎大鼠模型,评价鞘内注射P300的沉默质粒(siRNA-P300)对关节炎大鼠痛觉、炎性反应的影响,并探讨CaMK Ⅱ磷酸化的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠来源于重庆医科大学实验动物中心。二甲基亚砜(DMSO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6的ELISA试剂盒及CFA购于上海碧云天公司;Von Frey TM动态足底触觉测量仪购于上海玉研科学仪器有限公司;辐射热刺痛仪购于四川科仪诚科技有限公司。P300、P物质(SP)、c-fos,p-CaMK Ⅱ的抗体购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物的造模、给药与分组:3月龄雄性SD大鼠60只,体重181～233 g。实验期间动物饲养于重庆医科大学动物房,每日光照约12 h,自由饮食和饮水。所有大鼠饲养2周后进入实验。将大鼠随机分为A、B、C、D、E、F共6组(n=10):A组:仅为大鼠左后肢踝关节注射等体积0.9%氯化钠溶液作为对照组。B组:左后肢踝关节注射完全弗氏佐剂(CFA)诱导佐剂性关节炎模型大鼠;C组:鞘内注射阴性对照(siRNA-NC),其余操作与D组一致;D组:左后肢踝关节注射CFA诱导佐剂性关节炎模型大鼠,制备前10 min鞘内注射用于敲低P300的小干扰RNA(siRNA-P300);E组:鞘内联合注射siRNA-P300和油酸的溶剂二甲基亚砜(DMSO),其余操作与D组一致;F组:鞘内联合注射siRNA-P300和油酸(CaMKⅡ的激活剂),其余操作与D组一致。建模后1 d、7 d、14 d用电子千分卡尺测左后足跖厚度。

1.2.2 行为学检测:①利用Von Frey TM动态足底触觉测量仪检测大鼠的机械性缩足阈值(PWMT)。于建模前1 d,建模后1 d、7 d、14 d检测各组大鼠的疼痛刺激阈值,每次检测于上午8∶30～11∶30进行,波间隔设置为10,频率为10.0 Hz,强度1.000 V。测定时保持被检测肢体温度在37℃左右。将大鼠放入有机玻璃笼中,底部为1 cm×1 cm网格的铁丝网,安静20 min后开始测量。测痛仪的Von Frey纤维丝由下向上刺激大鼠右侧后肢足底,设定刺激力度在20 s内由0 g逐渐增强至26 g,当大鼠出现迅速缩足时刺激力度会停止;若未出现缩足反应,压力值增到26 g后也会自动停止。屏幕显示的压力值即为痛阈值,每只大鼠测3次。每2次测量间隔5 min,取其平均值。②另外,使用热辐射痛检测仪分别检测大鼠左后足的热缩足潜伏期(PWTL),与机械异位痛同时进行测试。将大鼠置于3 mm厚的有机玻璃箱(20 cm×40 cm×35 cm)中,适应30 min环境后确定PWTL。仪器参数设定红外强度为50,终止时间为20 s。红外线热源被放置在脚下并打开。爪子拔出后切断电源,自动记录照射时间。每次刺激间隔5 min,以避免潜在的组织损伤。

1.2.3 组织检测:动物腹腔内注射1%戊巴比妥钠麻醉,鞘内注射20 μl亚甲蓝确认导管位置。开胸灌流冲洗心脏,然后灌流固定40～60 min。大鼠在造模-1 d、1 d、7 d、14 d时取材制成切片。暴露脊柱棘突和横突,选L4和L5作入路。剪刀剪去部分棘突形成“V”形切口,暴露黄韧带和脊髓组织。咬去黄韧带和硬脊膜,继续咬去两侧的横突。钳下骨质暴露脊髓并取出,剪去脊神经节两端的脊神经干。将脊髓浸泡在4%多聚甲醛固定36 h,在30%蔗糖中脱水24 h。用O.C.T.进行包埋,在-20℃下切6 μm厚手动切片。吸附在载玻片上保存。用免疫荧光方法检测定位定性P300在脊髓中的表达。冷冻切片经过血清封闭并于室温回温,孵育兔抗大鼠的P300的一抗(1∶300)于湿盒中4℃过夜,复温30 min,随后避光下孵育山羊抗兔IgG二抗(黄红色DyLight 549,1∶200)1 h。使用甘油:0.01 mmol/L(1∶1)封片。荧光显微镜下拍照保存。

1.2.4 Western blot检测大鼠神转录因子和TRP、钠通道蛋白:冰浴中匀浆处理脊髓组织,冰上孵育20 min,随后离心15～20 min,收集上清,用酶标仪测定570 nm处的吸光值;计算样品中的蛋白浓度。行SDS-PAGE电泳(先45 V,后90 V),冰浴电泳1.5 h;使用NC膜进行转膜。使用Western Blot封闭液封闭用于检测的NC膜,室温封闭1 h,孵育SP(1∶500)、c-fos(1∶500)、磷酸化的CaMKⅡ(1∶800)、P300(1∶800)的一抗,室温孵育30 min后,放于4℃过夜;孵育二抗,室温孵育40 min,最后进行显色和曝光。

1.2.5 ELISA检测血清中TNF-α、L-1β、IL-6的表达:收集14 d大鼠血清。ELISA试剂盒检测TNF-α、L-1β、IL-6的表达水平。酶标仪检测A450的光密度。

1.3 观察指标 6组大鼠机械痛阈值,热缩足潜伏期,左后足跖厚度,脊髓SP、c-fos、P300、p-CaMK Ⅱ、CaMK Ⅱ的蛋白表达水平,血清中TNF-α、L-1β、IL-6的含量。

2 结果

2.1 大鼠机械痛阈值变化 动物行为学观察大鼠的MWT。与A组比较,B组造模后1 d、7 d、14 d的MWT值明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组在造模后1 d、7 d、14 d的MWT的变化差异无统计学意义(均P>0.05);与C组比较,D组在造模后1 d、7 d、14 d的MWT均上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组在造模后1 d、7 d、14 d的MWT均下调,差异均有统计学意义(均P<0.05);与D组比较,E组在造模后1 d、7 d、14 d 的MWT差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 6组大鼠机械痛阈值 n=10,MWT/g,

2.2 大鼠热缩足潜伏期变化 动物行为学观察大鼠的PWTL。与A组比较,B组造模后1 d、7 d、14 d的PWTL明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL变化差异无统计学意义(均P>0.05);与C组比较,D组在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL均增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与E组比较,F组在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL均缩短,差异均有统计学意义(均P<0.05);与D组比较,E组在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 6组大鼠辐射热潜伏期 n=10,PWIL/S,

2.3 大鼠脊髓SP和c-fos的变化 检测大鼠造模后14 d脊髓的SP和c-fos的表达变化。A组SP和c-fos的表达水平明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组SP和c-fos的表达差异无统计学意义(P>0.05);与C组比较,D组SP和c-fos的表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组SP和c-fos的表达水平上调,差异均有统计学意义(均P<0.05);但与D组比较,E组SP和c-fos的水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 6组大鼠脊髓SP和c-fos的相对表达 n=10,

2.4 大鼠左后足跖肿胀程度变化 测量大鼠左后足跖厚度变化。与A组比较,B组造模后1 d、7 d、14 d的足跖厚度增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组在造模后1 d、7 d的足跖厚度减少,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 6组大鼠左后足跖厚度 n=10,cm,

2.5 大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的变化 检测大鼠造模后14 d血清TNF-α、L-1β、IL-6的变化。与A组比较,B组造模后TNF-α、L-1β、IL-6的水平上调,差异均有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组TNF-α、L-1β、IL-6的水平变化差异无统计学意义(P>0.05);与C组比较,D组TNF-α、L-1β、IL-6 的水平下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组TNF-α、L-1β、IL-6上调,差异均有统计学意义(P<0.05);与D组比较,E组TNF-α、L-1β、IL-6的水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表5。

表5 大鼠血清炎性因子水平 n=10,

2.6 大鼠脊髓CaMK Ⅱ的磷酸化水平变化

2.6.1 免疫荧光结果显示:与A组比较,B组P300的表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组P300水平变化差异无统计学意义(P>0.05);与C组比较,D组P300的水平下调,差异有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组的P300上调,差异有统计学意义(P<0.05);与D组比较,E组的P300的水平无统计学意义(P>0.05)。

2.6.2 蛋白免疫印迹检测大鼠造模后14 d脊髓p-CaMK Ⅱ的表达变化:A组的p-CaMK Ⅱ的表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组p-CaMK Ⅱ表达差异无统计学意义(P>0.05);而与C组比较,D组的p-CaMK Ⅱ的表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组的p-CaMKII表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05);但与D组比较,E组的p-CaMK Ⅱ的水平无统计学意义(P>0.05)。见图1、2,表6。

图1 蛋白免疫印迹检测大鼠脊髓的P300和p-CaMK Ⅱ的表达

A组 B组 C组

表6 大鼠P300蛋白和CaMKII的磷酸化的相对表达水平 n=10,

3 讨论

关节炎是目前导致严重威胁人类健康的关节疾病,每年关节炎的新发病例数和致残总数都在增加。关节炎患者会产生不同程度的疼痛,降低生活质量[1]。关节炎的炎性痛机制较为复杂,容易出现异常性疼痛和痛觉过敏[10],由于其病因的多样性和复杂性,炎性导致的疼痛已成为关节炎机制研究的关键[11]。

本研究使用CFA模拟临床的关节炎性疼痛。观察到与对照组大鼠比较,CFA诱发的关节炎性疼痛大鼠中的机械性异常性疼痛持续1个月,另外,本研究也观察到了CFA注射后的慢性热痛觉过敏现象持续半月。因此本研究着重研究了1 d、7 d、14 d大鼠的关节炎性疼痛机制。我们还观察到CaMK Ⅱ参与到了佐剂性关节炎大鼠的疼痛和炎性反应。

首先,动物行为学结果显示,CFA关节炎大鼠表现出明显疼痛反应,其中机械痛觉过敏的症状持续至少28 d,而热痛觉过敏持续至少维持15 d。因此,本实验结果表明,CFA诱导下,大鼠关节的促炎反应加剧,不仅可以诱导机械痛觉过敏还可以诱导热痛觉过敏。这与Avrampou 等[12]的研究一致。其次,内钙的相关级联反应导致神经痛觉敏化,而且研究表明CaMK Ⅱ的磷酸化水平升高作为痛觉敏化的关键表征之一[13],因此我们研究了CFA关节炎大鼠脊髓中CaMK Ⅱ的磷酸化水平。蛋白免疫印迹结果观察到,在CFA刺激后的14 d,大鼠脊髓组织中CaMK Ⅱ的磷酸化水平明显增加。然而,大鼠在术前接受鞘内注射siRNA-P300,可观察到明显的磷酸化CaMK Ⅱ水平被抑制的现象,此结果表明,沉默P300抑制了CFA关节炎大鼠脊髓组织中CaMK Ⅱ的磷酸化水平。

作为HAT家族成员,P300蛋白在以往被证实可以参与CCI神经性痛觉过敏,我们的结果证实,P300在CFA模型大鼠脊髓中表达显著增加,表明P300可能对CFA疼痛的机制具有潜在的调节作用。另外,P300激活后可以引起CaMK Ⅱ的磷酸化[4,14,15]。在外周和中枢敏化过程中CaMK Ⅱ的磷酸化扮演重要作用[9]。研究表明,CCI神经性痛觉过敏大鼠在造模前接受鞘内注射CaMK Ⅱ抑制剂m-AIP可导致CaMK Ⅱ的磷酸化被抑制,因此表现出痛觉过敏行为减轻的现象,维持了7 d[6]。本研究在大鼠脊髓中利用P300的siRNA成功降低P300的表达。观察到与CaMK Ⅱ抑制剂m-AIP类似的结果;但是P300被沉默后,我们还观察到14 d痛觉过敏行被减轻的效果,观察到脊髓中的疼痛标志物SP和c-fos表达同样被抑制;而在P300沉默的基础上继续使用CaMK Ⅱ激活剂油酸后,痛觉过敏行为反而部分增强,且SP和c-fos表达部分上调,但是油酸对P300的表达未产生显著影响。因此本研究结果表明,在脊髓中沉默P300可能通过抑制CaMKII的磷酸化抑制CFA大鼠的炎性痛觉过敏。

另外,与对照组比较,CFA组大鼠的足跖厚度增加,而预先注射siRNA-P300,CFA大鼠的足跖厚度在7 d内被明显抑制,表明siRNA-P300可以抑制关节炎大鼠的关节水肿。我们还检测大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的变化。本研究结果显示siRNA-P300降低了TNF-α、L-1β、IL-6水平,然而注射油酸后,大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的水平都增加。因此,本研究证明关节大鼠鞘内注射siRNA-P300有抗炎作用,抑制CaMKII的磷酸化是siRNA-P300抗炎作用的关键机制之一。

本研究深入探讨了关节炎性疼痛的机制,并观察到脊髓SP、c-fos、P300蛋白、CaMKⅡ的磷酸化水平表达均增加,与观察到的CFA大鼠疼痛行为相对同步,这表明CaMK Ⅱ可能介入与疼痛有关信号通路的调节。研究表明,大鼠中皮下注射甲醛后,CaMK Ⅱ磷酸化在脊髓背角显著增加,时间与发炎性疼痛出现的时间高度一致[16]。这进一步证实CaMK Ⅱ可作为炎性痛的标志物或治疗靶点。另有相关机制研究证实,CaMK Ⅱ经历自身磷酸化并激活天冬氨酸NMDA受体,以促进痛觉过敏的持续形成[17,18]。以上这些结果表明,在临床治疗关节炎性疼痛中,连续给CaMK Ⅱ磷酸化的抑制剂可能更有效,而沉默P300对CaMK Ⅱ磷酸化的抑制作用更明显,因而可作为新的关节炎性疼痛的治疗靶点。

综上所述, P300介导的CaMK Ⅱ磷酸化在关节炎性疼痛和炎性反应中起着重要作用。通过使用siRNA-P300抑制CaMK Ⅱ的磷酸化,可在一定的时间内有效改善大鼠的疼痛行为和炎性反应,为关节炎性疼痛的临床治疗提供了新思路。