肌萎缩侧索硬化相关免疫细胞的研究进展

苏博洋，何正卿，黄旭升△

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种累及上、下运动神经元的神经系统变性疾病［1］，病变主要累及大脑皮质、脑干和脊髓的运动神经元。其基本病理特点是大脑皮质运动区的锥体细胞和脊髓前角细胞变性丢失。临床表现为进行性肌无力、肌萎缩、肌束颤动等。多数患者在起病后3～5 年因呼吸衰竭死亡［2］。越来越多的证据表明，固有免疫应答和适应性免疫应答都可影响ALS的进展［3］，因此明确ALS 过程中各类免疫细胞在两类免疫应答反应中发挥的功能有助于了解ALS 的免疫机制。本文从单核细胞/巨噬细胞激活、自然杀伤细胞数量增加、小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生及T淋巴细胞浸润等参与ALS发病进行综述。

1 单核细胞/巨噬细胞

人单核细胞主要分为3 个亚群：经典亚群（CD14+CD16-）、非经典亚群（CD14－CD16＋）、中间亚群（CD14+CD16+），这些亚群通过不同表面标记和它们在疾病中的功能而彼此区分［4］。散发性ALS（sporadic ALS，sALS）患者外周血中单核细胞的数量增加［5］，单核细胞比例发生改变，经典单核细胞和非经典单核细胞的比例均增加［6］。Cui 等［7］发现sALS 患者外周血单核细胞数量与病程呈正相关，与修订版肌萎缩侧索硬化功能评分（ALS functional rating scale revised，ALSFRS-R）呈负相关，与疾病进展速率和生存期无关。此外，在疾病进展过程中常伴随单核-巨噬细胞系统的功能失调。Zondler等［8］发现sALS患者单核细胞的吞噬能力明显下降，吞噬体到溶酶体的运输明显受损。与健康对照组相比，sALS患者外周血单核细胞产生更多白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，且IL-6 和TNF-α与疾病严重程度和进展速度呈正相关［9］。这些研究提示，在ALS的发展过程中伴随着单核细胞数量的增加，这些细胞可能通过分泌促炎细胞因子介导炎症反应，减少外周单核细胞的激活有可能为ALS患者提供一种新的治疗方法。

关于单核细胞对中枢神经系统（central nervous system，CNS）的浸润目前尚存在争议。在发病前1～2 个月SOD1G93A转基因小鼠脾中的Ly6chi单核细胞具有明显的促炎性，随着疾病进展，Ly6chi单核细胞中的C-C趋化因子受体2和小胶质细胞中的C-C趋化因子配体2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）表达增加，导致Ly6chi单核细胞浸润到脊髓，在使用抗Ly6C单克隆抗体治疗SOD1G93A转基因小鼠后发现，通过减少Ly6chi单核细胞对小鼠脊髓的浸润数量而延缓疾病进展并减轻神经元损伤［10］。与上述研究结果不同的是，Zondler等［8］在SOD1G93A转基因小鼠出生后第65天开始应用Fc融合蛋白，增加CNS中Ly6c单核细胞浸润的数量，发现疾病进展速度有所延缓，提示单核细胞在疾病早期具有保护作用。综上，单核细胞在ALS 的疾病进展过程中可被激活，并浸润到CNS，但对ALS的具体作用尚不明确，需要更多研究阐明。

2 自然杀伤（NK）细胞

NK 细胞为先天免疫系统的效应淋巴细胞，是机体抵抗感染的第一道防线，不依赖抗体和补体就可直接杀伤靶细胞，其功能受到体内多种细胞因子的调控。在一项纵向队列研究中，sALS 患者外周血中NK 细胞数量与病程呈正相关［11］。Garofalo 等［12］在SOD1G93A转基因小鼠中发现NK 细胞在大脑皮质和脊髓中数量增多，对表达NK 细胞活化性受体（NKG2D）配体的SOD1G93A转基因小鼠的运动神经元发挥神经毒性作用，利用TDP43A315T转基因小鼠研究发现NK细胞耗竭可降低运动神经元退化的速度，增加存活率。上述动物实验显示，清除NK细胞后小鼠脊髓中的小胶质细胞数目减少，胞体体积减小。小胶质细胞可分泌IL-6、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶等促炎因子，在清除NK 细胞后这些促炎因子的分泌均减少，表明NK 细胞在ALS 发展过程中对机体免疫应答发挥重要的调节作用［12］。有研究发现，与雌性SOD1G93A转基因小鼠相比，雄性SOD1G93A转基因小鼠CNS中存在更多的NK细胞，且NK细胞耗竭可导致雌性小鼠中枢神经系统的小胶质细胞数量减少，其存活率增加，但对雄性小鼠无明显改善，这表明ALS 进展中不同性别可能存在不同的免疫机制［13］。这些研究结果提示NK细胞在ALS中发挥神经毒性作用，可直接参与到CNS小胶质细胞的炎症反应中。不同性别之间免疫系统功能存在差异，有望作为评估ALS免疫治疗时的关键变量。

3 小胶质细胞

小胶质细胞是CNS中主要的免疫细胞，对神经系统的稳态维持起着重要作用，当脑内发生病变时，小胶质细胞可快速迁移增殖并启动免疫反应。Tondo 等［14］通过11C-PK11195正电子发射计算机断层成像扫描发现在携带SOD1突变的ALS 患者大脑枕叶、颞叶、小脑和延髓中均存在转位因子蛋白的表达水平增加，提示有活化的小胶质细胞，为进一步分析ALS发病过程中小胶质细胞的功能状态、活化位置提供了依据。小胶质细胞存在2种表型，M1毒性表型可产生活性氧和促炎细胞因子，M2 保护性表型可产生抗炎细胞因子及神经营养因子。动物实验显示，在SOD1G93A转基因小鼠疾病早期小胶质细胞主要为M2 型［15］。此外，小胶质细胞可通过吞噬异常蛋白起到神经保护作用，髓样细胞2上表达的触发受体（trigger receptor on myeloid cell 2，TREM2）是一种位于小胶质细胞表面的受体。最新研究表明，TREM2缺乏会损害小胶质细胞对病理性TAR DNA 结合蛋白43（TAR DNA binding protein-43，TDP-43）的吞噬清除能力，而且在ALS 患者大脑皮质和脊髓中存在TDP-43 和TREM2 的相互作用，因此在ALS中TREM2可能介导了小胶质细胞的神经保护作用［16］。

在SOD1G93A转基因小鼠疾病晚期小胶质细胞主要为M1型［15］。有研究表明，超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）或TDP-43 在细胞内聚集是M1 表型产生炎症反应的关键因素［17-18］。此外，SOD1G93A转基因小鼠中病理性SOD1可激活小胶质细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体，从而促进炎症反应［19］。上述研究提示，小胶质细胞在ALS中具有神经保护和细胞毒性功能，SOD1或TDP-43的错误折叠和聚集可促进小胶质细胞活化，诱导其神经毒性，加剧运动神经元的损伤，TREM2和NLRP3可能是潜在的治疗靶点。

4 星形胶质细胞

星形胶质细胞尚未被确认为免疫细胞，但可通过调节免疫反应损伤运动神经元。Granatiero 等［22］研究发现抑制胰岛素样生长因子1受体信号通路可降低人源SOD1G93A诱导性多能干细胞来源的星形胶质细胞的增殖速度并减弱其对运动神经元的毒性作用。不仅如此，星形胶质细胞还可以通过产生众多的细胞因子来影响运动神经元的活性［23］。SOD1G93A转基因小鼠脊髓中可检测到来源于星形胶质细胞的NLRP3炎症小体和IL-1β，两者水平随疾病进展而升高，可引起运动神经元周围的炎性反应［24］。SOD1G93A转基因小鼠运动神经元上的主要组织相容性复合物Ⅰ类（MHCⅠ）分子表达量减少，这使得运动神经元对星形胶质细胞介导的神经毒性更敏感，易致更多运动神经元死亡，增强运动神经元上MHCⅠ的表达能够使运动神经元免受星形胶质细胞介导的神经毒性，小鼠的运动能力和生存率均得到改善［25］。这提示MHCⅠ的表达可影响疾病的进展，对运动神经元具有保护作用。一项涵盖所有公开的ALS（患者和小鼠模型）星形胶质细胞测序数据进行的荟萃分析显示，星形胶质细胞中可发现缺氧信号通路的激活，还可导致细胞内谷氨酸的含量增加，介导神经炎症和氧化应激反应，从而损害运动神经元［26］。因此，减少或逆转星形胶质细胞介导的炎性反应可能是治疗ALS 的方法之一，深入研究星形胶质细胞在疾病过程中的功能变化有助于明确潜在的治疗靶点。

5 CD4＋T细胞

淋巴细胞分类中CD4＋T 细胞属于T 辅助细胞，占总T 淋巴细胞的40%，其数量可直接反映机体的免疫功能。研究显示，sALS患者外周血中CD4＋T淋巴细胞数量减少，随着这种细胞数量的减少，ALS 患者更容易发生认知障碍，因此外周血CD4＋T 细胞数量被认为是ALS 患者认知功能损害的一个预测因子［27］。然而，有些sALS 患者外周血中CD4+T 细胞未减少，其免疫抑制表型如Treg、CTLA4+T细胞和PD-1+CD4＋T细胞随疾病进展而增多［28］。这种不同可能是由个体免疫应答异常引起。与对照组相比，sALS患者外周血CD4+T细胞的数量随着疾病进展呈下降趋势，且其下降速度与ALSFRS-R评分下降呈负相关［11］。上述研究提示CD4＋T细胞在ALS进展过程中有保护作用，其数量的变化与疾病进展有关，但目前尚未阐明CD4＋T细胞在疾病进展中的作用机制。

6 CD8＋T淋巴细胞

CD8＋T 细胞又称为细胞毒性T 淋巴细胞，占总T 淋巴细胞的30%，CD8分子是MHCⅠ类限制性T细胞识别抗原的辅助受体，能够与MHCⅠ类分子结合而辅助T细胞抗原受体识别其提呈的抗原，在机体适应性免疫应答中起着重要作用。SOD1G93A转基因小鼠和sALS 患者的脊髓中均有CD8＋T 细胞的浸润，且CD8＋T细胞的数量与存活的运动神经元数量呈负相关；脊髓灰质中活化的CD8＋T细胞可以产生γ-干扰素，促进运动神经元上MHCⅠ的表达，并通过Fas细胞凋亡信号转导通路和颗粒酶途径发挥细胞毒性作用，选择性地杀死运动神经元［29］。CD8+T 细胞数量的下降保护了SOD1G93A转基因小鼠颈膨大处的运动神经元，延长了其生存时间［30］。此外，Nardo等［31］发现SOD1G93A转基因小鼠受损的腰骶段运动神经元中CCL2、MHCⅠ和补体C3 等免疫分子显著增加，伴有周围神经系统中CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞的大量浸润，浸润后的CD8＋T 细胞能促进周围神经系统中运动轴突和神经肌肉接头的髓鞘再生。综上，CD8＋T细胞和运动神经元之间存在特异的MHCⅠ依赖性相互作用，从而促进运动神经元死亡。但CD8＋T细胞不仅具有神经毒性，也可以起到保护运动神经元的作用。

7 调节性T细胞（Treg）

Treg 的表型主要为CD4+CD25+Treg，是一类具有负性调节作用的T 细胞亚群，占外周血CD4＋T 细胞数的5%～10%，其特征是在细胞内表达叉头状转录因子P3（FoxP3）。FoxP3是Treg 发育成熟和发挥功能的关键转录因子。Treg 可通过主动调节的方式抑制正常机体内自身反应性T 细胞的活化与增殖，当Treg细胞的活性和数量处于异常状态时易导致机体免疫功能失调。

有多项研究对ALS 进展中各个时期的Treg 数量进行了探索。疾病早期，SOD1G93A转基因小鼠中的Treg可浸润CNS，发挥抑制炎症反应的作用［32］。疾病晚期，SOD1G93A转基因小鼠体内的Treg 数量减少，效应T 细胞的增殖能力变强，由此提示Treg功能异常，加快了疾病的进展速度［33］。上述研究表明，疾病早期Treg 数量增加可以减弱神经炎症反应，是介导神经保护功能的淋巴细胞亚群。疾病晚期Treg数量下降，神经保护功能减弱或消失。值得关注的是，Treg可以调节小胶质细胞、效应T 细胞等免疫效应细胞，促进运动神经元周围形成抑制炎症反应的微环境，从而使运动神经元的生长受到保护。Sheean 等［33］在SOD1G93A转基因小鼠中通过IL-2 诱导内源性Treg 增殖，可显著抑制小胶质细胞向促炎表型转换，从而延缓疾病的进展速度。此外，与健康对照组相比，sALS患者外周血中的Treg对效应T细胞增殖的抑制能力较差，表明ALS 患者外周血中的Treg 存在功能障碍，将功能障碍的Treg 进行体外扩增后，其对效应T淋巴细胞增殖的抑制能力可恢复到健康对照组Treg的水平，这表明进行体外扩增后的Treg可能提供了一种新的细胞疗法来减缓疾病的进展［34］。

8 小结

ALS的发病机制较为复杂，近些年越来越多的研究表明ALS的免疫系统存在异常，免疫细胞被激活可导致ALS中枢和周围神经系统形成慢性促炎环境，驱动免疫反应的细胞群在数量或功能上的差异都可影响本病的进展。这些免疫细胞的相关作用对于判断ALS 的进展及针对患者的个性化治疗提供了诊断依据和治疗的靶点，今后需要更多的研究讨论其具体作用机制，有望发掘出新的治疗方法。