靶向抑制NLRP3炎性小体在脊髓损伤中的研究进展

朱晶惠，魏栋敏，任淑婷，杨彦玲，赵琳

脊髓损伤是脊柱损伤中最严重的并发症，常导致损伤节段以下肢体严重的运动、感觉功能障碍以及大小便等自主神经功能障碍，伤后难以治愈，致残率高。脊髓损伤后继发性损伤会引发一系列复杂的炎症级联反应。损伤后核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是一类免疫细胞激活后介导胱天蛋白酶1（caspase-1）活化的蛋白质复合物［1］，NLRP3 炎性小体活化可促进炎性细胞因子风暴形成，产生严重的炎症级联反应，加重机体损害程度。靶向抑制脊髓损伤后NLRP3炎性小体激活，减轻脊髓损伤后机体的炎症反应、减少并发症，是临床治疗脊髓损伤的有效方法。本文阐述了NLRP3炎性小体的结构和激活途径，就脊髓损伤后靶向抑制NLRP3炎性小体激活的研究进展进行综述。

1 NLRP3炎性小体的结构

NLRP3 是一类胞浆内模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）组成的蛋白质复合物，由NOD 样受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a card domain，ASC）衔接蛋白及pro-caspase-1 效应蛋白3部分组成［2］。NLRP3炎性小体C端富含亮氨酸重复序列结构域（leucine-rich repeats，LRR）；中间有核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD），又称NACHT 结构域；N 端是吡啶域（pyrin domain，PYD）和半胱天冬蛋白酶募集域（caspase recruitment domain，CARD）。ASC 衔接蛋白同时具有1 个CARD 结构域和1 个PYD结构域。pro-caspase-1效应蛋白只含有1个CARD结构域。在机体损伤时，PRRs 能快速识别损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）和病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），受体蛋白可被激活，通过PYD 介导下游信号，利用ASC 和procaspase-1 的CARD 域相互作用，形成NLRP3 炎性小体复合物［3］。

2 NLRP3炎性小体的激活

NLRP3炎性小体的激活需要2条信号通路的参与。第1条是启动信号通路：细胞膜表面Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）能够识别危险信号分子DAMPs和PAMPs，进而激活核因子（NF）-κB信号通路［4］，在炎性小体前体转录水平增加其表达量。第2条是激活信号通路：NLRP3炎性小体充当感受器感受机体损伤释放的DAMPs 和病原体释放的PAMPs 的刺激，但是NLRP3 并非直接与所有激活剂相互作用，而是接受这些激活剂所产生的细胞内信号［5］。其激活的信号通路途径见图1。现阶段研究证明，NLRP3 激活的细胞内信号主要包括活性氧（ROS）生成、线粒体功能障碍、离子流失稳及溶酶体损伤破裂［6］。

Fig.1 Signaling pathways activated by NLRP3 inflammasome图1 NLRP3炎性小体激活的信号通路

3 靶向抑制NLRP3炎性小体对脊髓损伤的作用

脊髓损伤后NLRP3炎性小体上调参与炎症反应，白细胞介素（IL）-18、IL-1β 等炎性因子表达量增加，并介导了细胞焦亡［7］。而这些促炎因子与焦亡后释放的内容物均可以作为促炎信号引发更大的炎症级联反应，产生有害物质，不利于机体恢复。

季英楠等［8］进行了大鼠脊髓损伤后NLRP3 炎性小体表达对运动功能影响的研究，用白细胞三烯受体抑制剂减少NLRP3的表达，发现实验组大鼠在组织学和行为学上较对照组损伤明显减轻。Li 等［9］也证实抑制NLRP3 活化可以减轻微环境炎症反应，促进小胶质细胞向M2表型极化，改善小鼠脊髓损伤后运动功能恢复。因此靶向抑制NLRP3 的激活可以减轻脊髓损伤后的炎症级联反应，减少神经细胞损伤，促进机体损伤后感觉与运动功能的恢复。

3.1 靶向NLRP3启动信号通路的调控

NF-κB是免疫系统的关键调节因子,许多促炎细胞因子和免疫调节介质的启动子区域均有其结合位点，因而NF-κB信号通路是启动NLRP3 炎性小体活化最主要的通路。Zhao等［10］研究表明芍药醇可通过抑制Toll 样受体/髓样分化因子88/核因子-κB（Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor-κB，TLR4/MyD88/NF-κB）信号通路减少大鼠脊髓损伤中NLRP3炎性小体的活化和细胞焦亡。Liu等［11］研究也证实山奈酚可以抑制丝裂原活化蛋白激酶/NFκB（mitogen activated protein kinases/NF-κB，MAPKs/NF-κB）信号通路，减轻大鼠脊髓损伤后的炎症反应。Guo等［12］研究提示腺苷酸蛋白活化激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是NF-κB和NLRP3炎性小体信号通路的上游调节因子，该因子的活化可抑制NF-κB/NLRP3 信号通路的激活。紫雏菊苷［13］、雷公藤红素［14］和长托宁［15］等中药提取物均可以通过对NF-κB 信号通路的抑制，减少NLRP3 炎性小体的表达以及促炎因子前体的转录与成熟，进而抑制NLRP3组装和激活，减轻炎症反应，促进脊髓损伤大鼠运动功能的改善。然而NF-κB信号通路激活具有免疫耐受现象，其信号通路的负向调节因子功能丧失或调控关键效应的基因突变增强均可加重脊髓损伤后的炎症效应。因此，研发针对NF-κB信号通路的抑制剂至关重要。

3.2 靶向NLRP3激活信号通路的调控

3.2.1 ROS生成和线粒体功能障碍

ROS 主要来源于线粒体释放的线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS），此外，损伤后大量腺苷三磷酸（ATP）的释放也可以诱导ROS生成，从而激活NLRP3 炎性小体［16］。基础研究中虽已明确ROS 是激活NLRP3 炎性小体的因素之一，但其介导的激活机制并不明了。Qayyum 等［17］研究表明，mtROS 介导的NLRP3 炎性小体激活可能是由硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）和硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的结合作用下诱导的，在正常情况下TPX 与TXNIP 紧密结合，而损伤后ROS的高表达导致TRX与TXNIP解离，随后解离的TXNIP与NLRP3 炎性小体结合并被激活。线粒体损伤释放mtROS 的同时，也释放线粒体DNA到细胞基质中，氧化的线粒体DNA可与黑色素瘤缺乏因子2 相互作用并激活NLRP3 炎性小体［16］。

因此，抑制ROS 生成或维护线粒体稳态减少其损伤，可减少NLRP3 炎性小体的激活。如N-乙酰-L-半胱氨酸以及白藜芦醇［18］、阿魏酸钠［19］、木犀草素［20］等具有抗氧化的药物均可在脊髓损伤中抑制ROS 生成，减少NLRP3 炎性小体激活，从而减轻炎症级联反应。Lin 等［21］采用小鼠小胶质细胞制备了NLRP3 炎性小体的激活模型，再用亚甲蓝抑制ROS后，NLRP3 炎性小体的表达量显著降低，提示ROS 是NLRP3的上游信号通路。使用ROS 特异性抑制剂或可从源头减轻NLRP3介导的炎症反应。然而Mohamed等［22］研究发现，即便是在TXNIP缺陷的情况下，IL-1β的成熟与caspase-1的活化并未被完全抑制，这表明可能存在其他激活机制。

3.2.2 离子流失稳

离子流失稳包括K+外流、Ca2+动员和Na+内流，这些生物事件已被确定与NLRP3 炎性小体激活有关。P2X7 受体（P2X7 receptor，P2X7R）是嘌呤能离子型P2X 受体家族的成员之一，是非选择性ATP门控阳离子通道受体。机体损伤后细胞释放ATP 与P2X7 相互作用，离子通道被打开［23］。K+外流导致细胞内K+浓度降低，诱导NIMA 相关激酶7 与NLRP3的LRR 结构域作用，触发NLRP3 炎性小体组装激活［24］。离子通道打开后细胞外的Ca2+内流，内质网应激通过三磷酸肌醇受体和斯里兰卡肉桂碱受体通道将Ca2+释放到细胞质中［25］。另一方面，溶酶体破裂导致细胞器膜破裂，细胞器中的Ca2+释放也是细胞质中Ca2+增多的一个重要途径［26］。细胞质中高浓度的Ca2+促使ASC 寡聚和pro-caspase-1 组装以激活NLRP3炎性小体，其激活机制可能是Ca2+通过瞬时感受器电位M2 通道渗透作为ROS 内源性传感器而激活NLRP3 炎性小体［25］。Na+内流激活NLRP3炎性小体具有K+依赖性，其机制可能是单钠尿酸盐晶体刺激增加了Na+负荷和细胞肿胀，然后通过水内流被动平衡细胞，使K+降低到阈值以下，导致NLRP3炎症小体激活。

Kong 等［27］研究证实酮代谢物β-羟基丁酸（βhydroxybutyric acid，BHB）可以通过抑制NLRP3 炎性小体改善大鼠脊髓损伤后的炎症反应，BHB是直接通过阻滞K+外流和ASC 寡聚来减少NLRP3 炎性小体的激活。尼莫地平是一种典型的Ca2+通道阻滞剂，具有扩张脊髓血管的作用，可减少Ca2+内流，减轻炎症程度，减少细胞焦亡［28］。TWIK相关的K+通道1（TWIK-Related K+Channel 1，TREK-1）是双孔钾离子通道成员之一，该通道开放可以介导细胞超极化，抑制Ca2+通道激活、减少Ca2+内流。Fang 等［29］研究证实缺乏TREK-1 会使局部炎症扩大，而TREK-1激动剂花生四烯酸和亚麻酸可以抑制炎症反应，改善脊髓损伤小鼠运动功能。木犀草素同样也具有阻滞Ca2+内流、抑制NLRP3小体激活的作用［30］。利鲁唑是一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的钠离子阻滞剂。Wu 等［31］研究证实利鲁唑可以促进小胶质细胞向M2 表型极化，减少炎症反应，抑制NLRP3 炎性小体的激活。离子流在NLRP3 的激活机制中具有重要作用，深入了解离子通量与NLRP3 炎性小体之间的分子联系为研究脊髓损伤后靶向抑制NLRP3激活提供了新思路。

3.2.3 溶酶体破裂

Abuammar 等［26］研究发现一些晶体颗粒物，如胆固醇晶体、钙晶体、二氧化硅晶体等可通过吞噬作用诱导溶酶体肿胀破裂，致使NLRP3炎性小体被激活。其机制可能是溶酶体破裂释放的组织蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）可作为DAMPs被PRRs 识别，进而引发NLRP3炎性小体的组装激活［32］。脊髓损伤后，胞质磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipaseA2，cPLA2）被激活，导致溶酶体膜破裂释放CTSB，参与NLRP3炎性小体的激活。Li 等［33］采用cPLA2 的抑制剂花生四烯酰三氟甲基酮抑制cPLA2 激活，减少溶酶体损伤破裂，恢复自噬通量，抑制炎症反应，进而减少大鼠脊髓损伤后神经元细胞损伤。CA-074-Me 是一种有效的CTSB 抑制剂，可抑制caspase-1 活化，减少NLRP3 炎性小体的活化［34］。也有研究证明阿魏酸钠可以调节溶酶体功能，减少NLRP3炎性小体激活，改善大鼠脊髓损伤后的运动功能［19］。因此，减少CTSB的释放进而抑制NLRP3 炎性小体激活可成为治疗脊髓损伤的重要靶点。

3.3 其他

OLT1177是一类活性β-磺酰腈化合物，可直接靶向抑制NLRP3 炎性小体NOD 上的ATP 酶结合位点，抑制NLRP3 炎性小体活化［35］。过表达miR-423-5p［36］和miR-451［37］可直接在转录水平抑制NLRP3 mRNA的表达水平，减轻大鼠脊髓损伤后的炎症反应。MCC950 是一种针对NLRP3 炎性小体成分蛋白的特异性抑制剂，在脊髓损伤模型中MCC950可以有效阻断NLRP3诱导的ASC寡聚来抑制NLRP3炎性小体的激活，但它不能通过直接阻断NLRP3 寡聚或NLRP3-ASC 相互作用来阻止炎症小体的形成［38］。Jiang等［39］对脊髓损伤小鼠的研究表明，BAY 11-7082 和A438079 也可直接靶向抑制NLRP3炎性小体激活，改善炎症，减轻脊髓损伤。

4 小结

随着对NLRP3炎性小体激活机制研究的深入，在脊髓损伤中靶向抑制NLRP3 激活机制的研究也越来越多。一些基础和临床研究均证实NLRP3 在脊髓损伤后继发性炎症级联反应中至关重要。因而，以抑制NLRP3炎性小体为靶点或许可成为治疗脊髓损伤的新方法。虽然一些药物可以抑制NLRP3 的激活，或可通过阻断其信号通路减少转录表达，改善炎症，促进脊髓损伤后感觉与运动功能的恢复，但尚需更多的研究来验证。脊髓损伤中，NLRP3炎性小体的未知激活机制及信号通路之间的交联反应、NLRP3炎性小体及相关分子如何介导炎症级联反应、如何实现临床治疗的转化，依然需要更深入的探索。