QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中甲拌磷及其代谢物残留

梁景文，朱国柱，罗泽君，姜学涯，苑婷婷

(深圳凯吉星农产品检测认证有限公司，广东 深圳 518000)

引 言

甲拌磷是上世纪50年代由美国氰胺公司开发研制的一种高效有机磷杀虫剂，因其高性价比特性而被广泛用于害虫防治方面[1]。在自然条件下，甲拌磷经过氧化反应会代谢为甲拌磷砜和甲拌磷亚砜[2]。由于甲拌磷及其代谢物的高毒性，对人体伤害大，已被国家禁用，农业农村部公告第536号[3]自2022年9月1日起，撤销甲拌磷原药及制剂产品的农药登记，禁止生产。目前我国农药最大残留限量标准GB 2763[4]规定肉类中甲拌磷的限量为0.02 mg/kg，其检测方法参照GB/T 23210[5]规定的方法测定，而GB/T 23210适用于牛奶和奶粉中农药的测定，并不适用于肉类中农药的测定。因此针对营养丰富备受人们喜爱的牛肉这一食用农产品，建立一种甲拌磷及其代谢物残留量的检测分析方法具有重要的实际应用价值。

目前检测甲拌磷及其代谢物的主要方法有：荧光光度法[6]、气相色谱法[7]、气相色谱-串联质谱法[8]、液相色谱法[9]、液相色谱-串联质谱法[10]等。其中荧光光度法、气相色谱法和液相色谱法存在基质干扰较大，灵敏度低等缺点，气相色谱-质谱法和气相色谱-串联质谱法存在前处理繁琐，检测时间较长等缺点。目前我国尚未发布有关牛肉中甲拌磷及其代谢物检测方法的相关标准，因而急需建立一种实用且快速检测牛肉中甲拌磷及其代谢物的分析方法，满足食品安全国家标准的限量规定以及行业的诉求。本研究采用QuEChERS技术同时结合高效液相色谱-串联质谱方法，开发一种适用于牛肉中甲拌磷及其代谢物的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料 AB SCIEX QUAD 5500液相色谱-串联质谱联用仪；离心机；Millipore Q纯水机；MS 3 basic旋涡振荡器；移液枪；QuEChERS盐包、QuEChERS净化管、0.22 μm有机滤膜；牛肉样品。

甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜(纯度≥98%)；甲醇、乙腈(色谱纯)；甲酸、乙酸(分析纯)；乙酸铵(分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 标准储备溶液：分别准确称取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜各10.0 mg，用甲醇溶解并稀释至100 mL，摇匀，制成质量浓度为100 μg/mL标准储备溶液，-18℃避光保存，有效期3个月。

混合标准中间溶液：分别准确吸取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜标准储备溶液各1 mL，用甲醇稀释至10 mL，摇匀，制成10 μg/mL的混合标准中间溶液，再次准确吸取10 μg/mL的混合标准中间溶液1 mL，用甲醇稀释至10 mL，摇匀，制成1 μg/mL的混合标准中间溶液，0℃～4℃避光保存，有效期1个月。

混合标准工作溶液：分别准确吸取10、20、50、100、200 μL上述1 μg/mL的混合标准中间溶液，用甲醇稀释至 1 mL，得到质量浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL的标准工作曲线，临用现配。

1.2.2 样品前处理 称取10 g(精确至0.01 g)制备好的试样置于50 mL离心管中，加入20 mL 含1%乙酸的乙腈溶液提取分离，-18℃冷冻放置20 min；加入QuEChERS盐包迅速振摇至不发热，5 000 r/min离心2 min。取上层液6 mL至15 mL 的QuEChERS净化管中，涡旋3 min；5 000 r/min离心2 min，上清液供分析。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm×150 mm，3 μm)，柱温：40℃；流动相A：10 mmol/L乙酸铵(加0.1%甲酸)溶液；流动相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；进样体积：5.0 μL；梯度洗脱程序(表1)。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件 离子源：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；扫描模式：正离子模式；电离电压：5 500 V；雾化温度：550℃；喷雾气：50 psi；辅助加热气：50 psi；检测模式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；甲拌磷及其代谢物定性定量离子对及去簇电压、碰撞能量(表2)。

表2 甲拌磷及其代谢物定性定量离子对及去簇电压、碰撞能量

2 结果与分析

2.1 仪器工作条件的选择

2.1.1 色谱条件 液相色谱串联质谱法测定食品中多农残时常用含无机酸的无机盐溶液和甲醇溶液作为流动相[11]，经过多次试验，选择的流动相见1.2.3节，在此条件下，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜均能得到有效分离，且色谱峰峰形良好。

2.1.2 质谱条件 甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜属于磷酸酯类小分子农药，分子量为260.38、276.37、292.38，因此本试验采用传统的小分子质谱离子对优化方法电离其碎片离子对。通过优化去簇电压和碰撞能量，得到甲拌磷及其代谢物响应最佳的一对离子对用于定性定量分析(表2)，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的母离子均带单电荷。

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 萃取溶剂的优化 由于牛肉中含有丰富的蛋白质，在进行上机检测前需要去除蛋白，而甲拌磷及其代谢物的极性较强，易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，同时有机溶剂具有使牛肉中的蛋白质变性发生沉淀的效果[12]，因此本试验考察甲醇和乙腈作提取试剂进行分析。结果表明：当选择乙腈作为提取试剂，待测牛肉中蛋白质去除的效果较好，但是甲拌磷及其代谢物的提取效率不高，而当选择含有1%乙酸的乙腈溶液作为提取试剂时，不仅牛肉蛋白质去除效果较好，且提取效率>75%，这是因为甲拌磷及其代谢物在酸性条件下稳定不易分解。因此本试验选择含有1%乙酸的乙腈溶液作为提取试剂。

2.2.2 净化方法的优化 QuEChERS样品前处理方法，具有操作简便、处理速度快且溶剂消耗量少等优点，已被广泛应用于食品、环境和土壤污染物检测中[13，14]。因此本试验采用高效的QuEChERS萃取盐包及净化管，通过简单的离心操作，将甲拌磷及其代谢物与牛肉样品中的干扰组分(如脂肪酸、色素、脂类等)分离。QuEChERS萃取盐包中MgSO4用于除去样品中的水分，其他缓冲盐可调节样品溶液pH值，确保对碱性敏感的农药也有较好的回收率。由于加入萃取盐包后会放出大量热，导致甲拌磷及其代谢物分解，因此需在-18℃冷冻放置20 min后再加入盐包迅速振摇至不发热，这样可以确保提高甲拌磷及其代谢物的回收率。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应 分别用空白样品溶液和含1%乙酸的乙腈溶液配制的10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL混合标准溶液制作标准曲线，以各标准曲线斜率比值与1的差值作为基质效应值[15]，以考察基质效应，结果(表3)。

表3 甲拌磷及其代谢物的基质效应

表4 甲拌磷及其代谢物的线性方程、相关系数、检出限及定量限

由表3可知：牛肉基质对甲拌磷及其代谢物存在较强的基质抑制效应，为了降低基质的影响，试验采用基质匹配的混合标准溶液制作标准曲线。

2.3.2 线性范围、检出限和定量限 准确移取1 μg/mL适量甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的混合标准溶液，添加到10.00 g空白样品中，浓度为10、20、50、100、200 ng/mL的各系列空白添加试料，在上述液相色谱和质谱条件下测定，以峰面积为纵坐标Y，化合物浓度为横坐标X，绘制标准曲线。研究结果表明，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜在质量浓度 10～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r为 0.998 8～0.999 5，检出限为 3 ng/mL，定量限为10 ng/mL，标准色谱图(图1)。

图1 甲拌磷及其代谢物标准色谱图

2.3.3 回收率和精密度 选取空白样品，分别添加 3 个浓度水平的标准溶液，每个浓度水平制备 6 个平行样品进行添加回收率，在添加浓度范围内，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的回收率为77.2%～93.5%，相对标准偏差为 1.8%～6.2%，能够满足检测方法的要求，结果(表5)。

表5 精密度和回收试验结果(n=6)

2.4 实际样品测定 采用本研究建立的方法检测深圳农贸市场购买的20个牛肉样品，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜均未检出。

3 结论

本研究建立了QuEChERS技术同时结合高效液相色谱串联质谱法测定牛肉中甲拌磷及其代谢物残留的分析方法，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜在质量浓度 10～200 ng/mL 范围内线性关系良好，检出限为 3 ng/mL，定量限为 10 ng/mL。本方法快速、准确、灵敏度高，能够满足国家标准规定的牛肉中甲拌磷及其代谢物残留限量的检测要求。