河北省大豆孢囊线虫致病型分化研究

李秀花，王容燕，高波，马娟，高占林，赵惟，万艳争，陈书龙

（河北省农林科学院植物保护研究所/ 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/ 农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北 保定 071000）

大豆孢囊线虫（soybean cyst nematode，SCN；Heterodera glycines，Ichinohe） 属于一种土传的定居性内寄生线虫，分布遍及世界主要大豆生产国[1]，严重威胁着大豆的安全生产。SCN 引起的大豆孢囊线虫病是世界上为害大豆严重的病害之一，在美国每年造成的经济损失超过10 亿美元[2]。目前，SCN 在我国黑龙江、吉林、辽宁、山东、江苏、河北等22 个省（直辖市、自治区）均有发生[3]，每年造成的大豆受害面积超过150 万hm2，严重发病地块大豆减产30%以上，甚至绝收[4]。

SCN 是专性寄生物，具有明显的遗传多样性。1970 年Golden 等提出用“生理小种”来表示SCN 的种内致病性变异，并且用Pickett、Peking、PI88788 和PI90763 这4 个大豆品种作为SCN 生理分化的鉴别寄主，用感病大豆品种Lee 68 作为标准对照[5]。1988 年美国线虫学家Riggs 等利用SCN 在4 个鉴别寄主上的可能反应，理论上把SCN 划分成16 个生理小种[6]，称之为Race 鉴定体系。但由于该鉴定体系包含的抗病基因较少，并不能完全把携带不同致病基因的SCN 群体区分开来，因此，Niblack 等在2002年又建立了一个新的SCN 基因多样性分类系统——HG 型分类鉴定体系[7]，以感病寄主对应的寄主序号来命名HG 型的类型。截至目前，采用Race 鉴定体系我国已报道有1、2、3、4、5、6、7、9、13、14号共计10个生理小种[8～18]。通过HG 鉴定体系已发现12 个HG 型，分别是0、7、2.7、5.7、1.3.7、2.5.7、1.2.5.7、1.2.3.5.7、1.2.3.4.5.6.7、1.2.3.5.6.7、1.3 和2.5.7[19～21]。使用这2 种鉴定体系对SCN 群体进行鉴定[20]，得到的结果并不完全对应。HG 型鉴定体系更能体现出SCN 不同毒力表型的多样性，但使用鉴别寄主过多，且鉴定所需的孢囊线虫群体数量远远多于Race 鉴定体系，因而，对于数量较少的SCN群体就无法进行有效的HG 型鉴定。

20 世纪90 年代河北省大豆种植面积最高达到52万hm2左右，之后逐年下滑。自2018 年国家实施大豆振兴计划以来，河北省大豆种植面积又开始出现恢复性增长，2022 年纯大豆种植面积达9 万hm2、大豆/玉米带状复合种植新模式面积约7 万hm2，大豆孢囊线虫病呈严重上升趋势。种植抗病品种是防治大豆孢囊线虫病最经济有效的措施，而深入了解SCN 的生理小种或HG 型是开展大豆抗孢囊线虫品种选育以及品种合理布局利用的重要前提。早在2006 年，河北省SCN群体已报道有1、2、5 号生理小种，无HG 型鉴定报道。SCN 的致病型变异与品种的更迭密切相关。截至目前，大豆种植面积锐减后的迅速扩张以及感病品种的大面积种植是否会引起河北省SCN 群体的毒性变异尚不明确。基于此，在河北省近几年大豆种植面积大且SCN发生重的地市采集土样，对其SCN 群体均采用Race和HG 型2 种鉴定体系进行鉴定，旨为大豆抗孢囊线虫品种选育以及大豆孢囊线虫的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆孢囊线虫致病型鉴别寄主共9 个，分别为Lee、Peking（PI548402）、PI88788、PI90763、Pickett、PI437654、PI209332、PI89772 和PI548316，其中Lee为感病对照。均由沈阳农业大学惠赠，并在河北省农林科学院植物保护研究所隔离繁育后使用。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆孢囊线虫病土采集 2020 年10 月大豆收获后，在河北省大豆主产区的邯郸市磁县、保定市安国市北扬城乡、唐山市丰台区岳龙镇、沧州市沧县周庄子和承德市滦平区平坊村大豆孢囊线虫病重病田，用军用铁铲在根围取土样，装入塑料袋，置于室外阴凉处。翌年4 月使用。

1.2.2 大豆鉴别寄主种子催芽 将9 个大豆鉴别寄主的种子，先用质量分数0.5%的NaClO 溶液表面消毒3 min，而后用无菌水冲洗干净，置于25 ℃左右的温水中浸泡6～7 h。将浸泡好的大豆种子置于内垫2 层灭菌滤纸的培养皿内，向滤纸上滴加无菌水2 mL，置于25 ℃恒温培养箱中催芽。经过3～4 d，待种子幼苗根长2 cm、芽长1 cm 左右时播入花盆。

1.2.3 大豆孢囊线虫病土配制 2021 年4 月下旬将采集的大豆孢囊线虫病土过筛，混合均匀后取200 mL，采用漂浮法[16]分离土样中的孢囊，统计饱满孢囊的数量。重复3 次取样。

为了减少试验误差，使各鉴别土壤中含有的线虫数量差别不是太大，对含有孢囊数量较多的土壤掺入一定量的灭菌细沙土（土、细沙体积比为1∶3），将各地区病土中的饱满孢囊数量调整至300～600 个/L（土样）。再次分离混合土样中的孢囊，确定孢囊数量。

1.2.4 大豆栽种与管理 用烧杯量取混合好的病土500mL 装入花盆（上口直径11cm、下口直径10.5cm），栽种1 株已催芽的鉴别寄主，覆土后浇水使土壤湿透，置于阳光温室（温度18～28 ℃）内，正常管理。每处理重复8 盆。

1.2.5 大豆病害调查 大豆生长42 d 后，在雌虫集中出现时进行调查。首先统计根系上的雌虫数量；然后利用漂浮法分离土壤中的孢囊[16]，在体式显微镜下统计孢囊数量。将根系上的雌虫数量与土壤中的孢囊数量之和，计为大豆孢囊线虫在大豆播种后42 d 内为害大豆并在大豆根系上所形成的雌虫总数。

1.2.6 致病性鉴定 主要依据孢囊线虫在不同鉴别寄主上的繁殖能力，即每个鉴别寄主的平均雌虫指数（female index，FI），对大豆孢囊线虫的生理小种类型[6]和HG 型[7]进行鉴定。FI计算公式为：

FI=鉴别品种每株根系上的平均雌虫数/感病对照品种每株根系上的平均雌虫数×100

其中，FI≥10 时为感病；FI＜10 时为抗病。

2 结果与分析

2.1 不同地区土壤中的孢囊数量

测定结果（表1）显示，5 个地区根围土样中含有的大豆孢囊线虫孢囊数量为340～2 763 个/L，均满足盆栽试验鉴别所需的发病条件。其中，沧州市土壤中的孢囊数量最高，承德市土壤中的孢囊数量最低，土壤中含有孢囊数量最多量是最少量的8 倍以上。

不同地区原有土样中的孢囊数量差异较大，为了减少试验误差，对含有孢囊数量较多的土壤掺入一定量的灭菌细沙土进行调整。调整后各鉴别土壤中的孢囊数量为340～603 个/L。

2.2 大豆孢囊线虫群体的生理小种鉴定

鉴定结果（表2） 显示，感病品种Lee 对5 个SCN 群体均表现为高度感病，平均雌虫数为195.9～295.5 个/株；5 个SCN 群体在4 个鉴别寄主上形成的雌虫数均较少，FI均＜10，鉴别寄主均表现为抗病，参照大豆孢囊线虫Race 鉴定体系生理小种划分标准[4]，沧州沧县群体、唐山丰台区群体、保定安国市群体、邯郸磁县群体和承德滦平区群体的生理小种均属于3号。

表2 河北省5 个市大豆孢囊线虫群体的生理小种鉴定结果Table 2 Identification of races of 5 SCN populations in Hebei Province

2.3 大豆孢囊线虫群体的HG 型鉴定

鉴定结果（表3） 显示，感病品种Lee 对5 个SCN 群体均表现为高度感病，平均雌虫数为181.9～275.3 个/株；5 个SCN 群体在7 个鉴别寄主上形成的雌虫数量均较少，FI均＜10，鉴别寄主反应均表现为抗病，参照Niblack 的HG 型鉴定体系划分标准[5]，沧州沧县群体、唐山丰台区群体、保定安国市区群体、邯郸磁县群体和承德滦平区群体的HG 型均属于0 型。

3 结论与讨论

3.1 讨论

大豆孢囊线虫不同群体间具有明显的寄生性分化，目前有生理小种[5，6]和HG 型[7]2 套鉴定体系。根据生理小种鉴定体系，截至目前，世界上报道SCN 生理小种类别最多的国家是美国，已报道有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15 号共计14 个生理小种，其中3 号和6 号为其优势小种[22]。我国已报道有1、2、3、4、5、6、7、9、13、14 号共计10 个生理小种，其中3 号小种分布于9 个省、4 号小种分布于8 个省、1 号小种分布于5 个省。此前河北省已报道有1、2、5 号生理小种[18]存在，分别分布在邯郸、藁城和沧县。本研究在邯郸市磁县、沧州市沧县、保定市安国市、唐山市丰台区和承德市滦平区又发现了3 号小种，至此，河北省已有1、2、3、5 号4 个生理小种的存在。根据HG 型鉴定体系，目前在我国已报道SCN 有12 个HG 型，分别为0、7、2.7、5.7、1.3.7、2.5.7、 1.2.5.7、 1.2.3.5.7、 1.2.3.4.5.6.7、 1.2.3.5.6.7、1.3、2.5.7[19～21]。本项目5 个SCN 群体的HG 型均鉴定为0 型。不同省份或者同一省份不同区域存在的生理小种或HG 型类型不同，可能与当地的气候条件、种植方式和栽培品种不同有关。

同一田块发生的SCN 群体通常是几个生理小种的混合体，很少存在单一的生理小种，通过鉴别寄主反应鉴别出来的只是某个占优势的生理小种[11]。在连年种植抗性寄主的选择压力下，SCN 生理小种的变异也常有发生[23]，如在黑龙江大庆市和安达市大豆孢囊线虫重病地连续种植抗病品种，导致这两地生理小种发生变异[11，24]，黑龙江省大庆市3 号小种分化为1 号或14 号小种[24，25]，安达市3 号小种分化为4 号、6 号或14 号小种[26，27]。本研究结果表明，河北省的SCN 出现了毒性最弱的3 号小种。而以前沧县是5 号小种，邯郸市是1 号小种[18]。探究原因，可能是本研究样品采集地点与原有采集地点不同；也有可能是近几年种植结构的调整，大豆种植规模变小；还有可能是农民选择种植一些缺乏抗性的农家品种，对SCN 造成的选择压力变小而使其毒性减弱。同样在HG 型鉴定体系中，同一地块SCN 群体通常存在几个HG 型。如，美国爱荷华州立大学2008 年对同一地块的4 个不同区域分别进行取样获得4 个样，对混合样品的HG 型测定结果为1.2.5.6.7，但其中2 个区域为1.2.5.7 HG 型，另2 个区域为1.2.3.5.6.7 HG 型[28]。这也说明，无论采用哪种鉴定体系，得到的鉴定结果均仅是SCN 群体的特征表现，而非某个个体线虫的特征表现。同时也说明，田间SCN 群体的复杂性[6]。同一块地SCN 致病型分化是动态的，常随着作物品种的变化而变化，因此，应加强SCN 致病型分化监测，为抗病品种选育与合理布局提供依据。

3.2 结论

对河北省5 个市的大豆孢囊线虫群体，通过2 套鉴别寄主，分别测定了每个鉴别寄主在鉴定体系中的FI；根据鉴定体系中每个寄主的FI划分所属的生理小种类型或HG 型。结果表明，河北省沧州沧县群体、唐山丰台区群体、保定安国市区群体、邯郸磁县群体和承德滦平区群体的生理小种均属于3 号小种，HG型均属于0 型。